考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定分子伴侶GroEL含量及優(yōu)化

蓋子璇　徐寶美

摘 要：[目的]研究不同條件對(duì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度過(guò)程中影響。[方法]以分子伴侶GroEL為研究對(duì)象，利用蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)顯色原理， 測(cè)定蛋白質(zhì)含量， 并對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]：考馬斯亮藍(lán)和蛋白的復(fù)合物在595nm處有最大吸收，反應(yīng)2～5min蛋白和染料結(jié)合恒定， 20℃孵育測(cè)量對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較小，蛋白質(zhì)含量受SDS干擾。測(cè)定所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線方為：y=0.0144x+0.0592 。[結(jié)論]本文從多方面探究了外界因素對(duì)其影響，發(fā)現(xiàn)采用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度、時(shí)間、溫度、干擾劑等都是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。

關(guān)鍵詞：考馬斯亮藍(lán)法；蛋白質(zhì)；GroEL；時(shí)間；溫度；干擾劑

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2018）04-0000-00

蛋白質(zhì)是生命體的基本元素 [1-2]。據(jù)前人研究，組織和細(xì)胞的更新和修補(bǔ)，物質(zhì)代謝，生理功能的調(diào)控以及能量供應(yīng)都離不開(kāi)蛋白質(zhì)[2]。蛋白質(zhì)正確折疊才能發(fā)揮功能，錯(cuò)誤折疊就會(huì)導(dǎo)致廢棄蛋白質(zhì)不斷積累，聚集，引起許多疾病，包括阿爾茲海默癥在內(nèi)的若干種神經(jīng)退化疾病，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究尤為重要 [3]。一般而言，生物體內(nèi)新生肽鏈的正確折疊需要分子伴侶的輔助，GroEL便是其中具有重要研究意義的分子伴侶 [4]。

蛋白質(zhì)定量測(cè)定有諸多應(yīng)用，例如科研研究、臨床檢驗(yàn)、疾病診斷，準(zhǔn)確定量對(duì)實(shí)驗(yàn)研究至關(guān)重要[5-6]。目前，測(cè)定蛋白含量常用的方法有紫外吸收法、凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法、考馬斯亮藍(lán)法等[7-9]。1976 年 Bradford 發(fā)明了考馬斯亮藍(lán)法（ G250）[10 -12]?？捡R斯亮藍(lán)G-250染料和蛋白質(zhì)結(jié)合，通過(guò)特征峰測(cè)定蛋白含量。同時(shí)，具有靈敏度高、測(cè)定快、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[11]。盡管考馬斯亮藍(lán)法有許多優(yōu)點(diǎn)，但也有許多因素影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文以分子伴侶GroEL為待測(cè)蛋白，研究顯示，溫度、時(shí)間、干擾劑等對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)均有影響[13]，可為今后科研工作中測(cè)定蛋白質(zhì)濃度準(zhǔn)確性提供建議和指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

（1）考馬斯亮藍(lán)G-250 購(gòu)自天根生化科技有限公司。

（2）牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 購(gòu)自天根生化科技有限公司。

（3）SDS（十二烷基硫酸鈉） 稱取SDS 10mg，蒸餾水定容至10ml。

（4）分子伴侶GroEL蛋白由實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取 10μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白，140μL PBS， 2.85mL考馬斯亮藍(lán)G-250，混勻，測(cè)紫外吸收光譜， 結(jié)果如圖1，染料蛋白復(fù)合物在 595nm 處有特征吸收峰。

在該波長(zhǎng)下測(cè)定蛋白復(fù)合物準(zhǔn)確性會(huì)比較高。

2.2 時(shí)間對(duì)吸收度的影響

取25μL1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白，125μL PBS緩沖液，2.85mL考馬斯亮藍(lán)G-250，混勻， 測(cè)時(shí)間掃描曲線， 結(jié)果如圖2所示，在 150～300s 范圍內(nèi)，吸光度趨于恒定。

2.3 SDS 干擾實(shí)驗(yàn)

（1）取6支5mLEP管，分別編號(hào)后按表 1～5 劑量依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白、SDS、PBS和考馬斯亮藍(lán)試劑。見(jiàn)表1。

（2）混合均勻20min 后，測(cè)A595nm。

SDS，陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，還可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，十二烷基部分是疏水結(jié)構(gòu)，可插入蛋白質(zhì)的疏水內(nèi)部，這樣，SDS就破壞了蛋白的疏水作用，從而破壞蛋白的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)，引起變性。

隨SDS量的增加，特征吸收值逐漸降低。加入SDS濃度為40～60uL時(shí)，混合液的595nm處的吸收峰急劇降低，呈直線下降趨勢(shì)，說(shuō)明SDS對(duì)蛋白的破壞程度增大了。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按表 2取樣。將溶液混合放置 2～5min后測(cè)量，記錄A595nm，見(jiàn)表1。

2.5 溫度對(duì)蛋白濃度的影響

取20μL1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白，130μL PBS緩沖液， 2.85mL考馬斯亮藍(lán)G-250，混勻，放置10min后，分別于10℃，20℃，30℃孵育5min，10min，15min，20min，25min，30min測(cè)A595nm，結(jié)果如表3。

正常室溫下同條件測(cè)的A值為0.520，放置10min后，不同孵育條件下結(jié)果顯示：隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度均逐漸下降。溫度為10℃，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比達(dá)到55%。當(dāng)溫度為30℃，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度比誤差百分比也達(dá)到55%。當(dāng)溫度為20℃，誤差最小。由此可見(jiàn)，高溫或低溫均會(huì)影響蛋白測(cè)定的濃度。20℃是考馬斯亮藍(lán)染料的最適溫度，在此條件下測(cè)定蛋白濃度表現(xiàn)出比較穩(wěn)定的結(jié)果，但孵育時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，短時(shí)間內(nèi)結(jié)果比較穩(wěn)定.并與之前結(jié)果相符。

2.6 樣品分子伴侶GroEL蛋白的測(cè)定

取1μL樣品，149μLPBS緩沖液， 2.85mL考馬斯亮藍(lán)G-250混勻，放置 2～5min 后，測(cè)A595nm。0號(hào)試管作空白，見(jiàn)表4。

3結(jié)語(yǔ)

根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)：時(shí)間、溫度、干擾劑等對(duì)蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定有一定影響。根據(jù)時(shí)間影響實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)2～5min蛋白復(fù)合物較穩(wěn)定。根據(jù)溫度變化實(shí)驗(yàn)，可知不同溫度條件下，蛋白濃度測(cè)定值都會(huì)隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。根據(jù)SDS干擾實(shí)驗(yàn)，蛋白質(zhì)含量測(cè)定隨SDS量的增加對(duì)蛋白影響越大。

綜上所述，時(shí)間、溫度、干擾劑等因素對(duì)考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度均有影響，要合理優(yōu)化測(cè)定方案，可進(jìn)一步提高測(cè)定的精準(zhǔn)度，為分子伴侶GroEL的后續(xù)研究奠定良好的基礎(chǔ)。

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作者簡(jiǎn)介：蓋子璇，女，山東威海人。