松乳菇多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性評價

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(貴州省植物保護研究所,貴州貴陽 550006)

松乳菇(Lactariusdeliciosus(L. ex Fr.)Gray)是一種菌根性真菌,屬擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、紅菇科(Russnlaceae)、乳菇屬(Lactarius)的真菌,是珍稀名貴野生食用菌類[1]。其子實體肉質細嫩,味道鮮美,營養(yǎng)豐富。現(xiàn)代藥理研究表明,松乳菇多糖具有抗腫瘤、調節(jié)免疫力、抗菌藥物等多種生物學活性和藥理功效[2-3]。邱美珍[4]報道,松乳菇菌絲體多糖和子實體多糖具有相似的藥理活性。與松乳菇子實體栽培的方法相比較,采用液體發(fā)酵松乳菇菌絲體具有生長周期短、成本低、不受季節(jié)的影響、可大規(guī)模工業(yè)化生產等優(yōu)點[5]。因此,以液體發(fā)酵松乳菇菌絲體提取多糖代替子實體提取多糖將是松乳菇產業(yè)化發(fā)展的一個趨勢,具有廣泛的開發(fā)運用前景和科學意義。

多糖是一類具有復雜結構的高分子化合物,廣泛存在于微生物、動物以及植物當中[6]。其中,微生物多糖是微生物發(fā)酵工業(yè)的新產品,與動物和植物多糖相比較,微生物多糖更有廣泛的應用,而且它的生產受地理環(huán)境、氣候、自然災害等因素的影響較小,生產周期短,產量及質量都很穩(wěn)定,其各方面的性能不僅優(yōu)良而且有著其他多糖不具備的特殊功能。因此,微生物多糖在很大程度上能滿足人們對天然無公害食品的需求,起著至關重要的作用[7]。微生物多糖的提取工藝有多種方式,主要有熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法以及酶提取法,其中,熱水堿浸提法時間長,效率低[8]；酸浸提法和堿提法容易引起糖降解及糖甘鍵斷裂,進而破壞多糖的活性結構[9],酶的價格高、又容易失活,在生產上應用困難[10]。超聲波輔助提取技術具有提取條件溫和、提取時間短和提取效率高等優(yōu)點[11-12],逐漸受到人們的青睞。近年來,超聲波輔助提取技術在多糖提取工藝領域得到了廣泛的應用。其中,在蠶蛹多糖[13]、銀耳多糖[14]、猴頭菇多糖[15]、姬松茸多糖[16]等天然產物多糖的提取中獲得了成功的應用。因此,本課題組以液體發(fā)酵松乳菇菌絲體為材料,采用超聲微波輔助熱水浸提法提取松乳菇多糖;在單因素實驗的基礎之上,運用響應面統(tǒng)計分析軟件優(yōu)化多糖提取工藝,并進行抗氧化活性檢測,為開發(fā)利用松乳菇多糖的相關產品和改進多糖高效制備工藝提供了理論依據(jù)和科學指導。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

松乳菇(Lactariusdeliciosus)由貴州師范大學微生物重點實驗室保藏菌種;種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1000 mL,pH自然);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)美國Sigma公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、維生素C、硫酸亞鐵、水楊酸、H2O2、葡萄糖、濃硫酸、丙酮、無水乙醇等均為國產分析純。

JA2003N型電子天平上海精密科學儀器有限公司;752E型紫外可見光分光光度計天津普瑞斯儀器有限公司;TD6型低速離心機長沙湘智離心機儀器有限公司;DH6000B型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋天津市泰斯特有限公司;TS-2102型雙層恒溫搖床上海夢藍儀器設備有限公司;DHG-9245A型恒溫鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司;RE-5286A型旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;FS-600N型超聲處理器上海生析超聲儀器有限公司;SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司;HVE-50型高壓蒸汽滅菌鍋HIRAYAMA公司。

1.2　實驗方法

1.2.1液體發(fā)酵將活化好的斜面菌種用無菌打孔器(6 nm)打成數(shù)顆菌絲塊,接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中,25 ℃,160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d后以15%的接種量轉接500 mL發(fā)酵瓶,每瓶液體量為200 mL,25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)8 d。

1.2.2多糖提取與制備發(fā)酵液用8層紗布過濾,將菌絲體置于60 ℃烘干至恒重,研磨粉碎,過60目篩。稱取一定量的松乳菇粉末于錐形瓶中,以一定的加水量先用微波處理30 min,再設定一定的提取溫度、提取時間、提取次數(shù)在恒溫水浴鍋中保溫提取,3500 r/min離心5 min,過濾并收集濾液,濃縮得多糖溶液。用3倍體積的無水乙醇醇沉過夜,3500 r/min離心10 min,棄上清液;加入約5倍體積丙酮洗滌沉淀,重復數(shù)次,直至丙酮溶液無色。用蒸餾水溶解沉淀,冷凍干燥,得到粗多糖。

1.2.3多糖含量分析準確稱取一定質量的松乳菇粗多糖,加水復溶后定容到一定體積,分別測定總糖和還原糖含量。

總糖含量的測定:采用硫酸-苯酚法[17];

還原糖含量的測定:采用DNS比色法[18];均以干燥至恒重的葡萄糖配制標準液,于490 nm波長處測定吸光度,得葡萄糖對照品溶液的回歸方程:y=0.4611x-0.0006,其相關系數(shù)R2=0.9996。

多糖含量=總糖含量-還原糖含量。

多糖得率(%)=多糖含量/松乳菇原料重量×100

1.2.4松乳菇多糖提取單因素實驗以松乳菇粗多糖得率為指標,分別考察提取溫度、提取時間、料液比以及提取次數(shù)對松乳菇多糖得率的影響,每組實驗重復3次。

1.2.4.1提取溫度分別稱取1.0 g松乳菇粉末3份,按料液比1∶30 (g∶mL)加入蒸餾水30 mL,超聲波處理10 min;設定提取時間2 h,提取2次,分別設定不同的溫度80、85、90、95、100 ℃提取，考察不同提取溫度對松乳菇多糖得率的影響。

1.2.4.2提取時間分別稱取1.0 g松乳菇粉末3份,按料液比1∶30 (g∶mL)加入蒸餾水30 mL,超聲波處理10 min;設定溫度90 ℃,提取2次,分別設定不同的時間1、1.5、2、2.5、3 h提取，考察不同提取時間對松乳菇多糖得率的影響。

1.2.4.3料液比分別稱取1.0 g松乳菇粉末3份,按不同的料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 (g∶mL)加入蒸餾水,超聲波處理10 min;設定提取溫度90 ℃,提取時間2 h,提取2次，考察不同料液比對松乳菇多糖得率的影響。

1.2.4.4總提取次數(shù)分別稱取1.0 g松乳菇粉末3份,按料液比1∶30 (g∶mL)加入蒸餾水30 mL,超聲波處理10 min;設定提取溫度90 ℃,提取時間2 h,分別設定回流總提取次數(shù)為1、2、3、4、5次，考察不同總提取次數(shù)對松乳菇多糖得率的影響。

1.2.5Box-Benhnken的中心組合實驗設計在單因素實驗的基礎上,以松乳菇多糖得率為響應面值,考察提取溫度(A)、提取時間(B)、液料比(C)和提取次數(shù)(D)為實驗因素,設計四因素三水平Box-Benhnken的中心組合實驗,對松乳菇多糖提取工藝進行優(yōu)化分析(表1)。

表1　響應面實驗因素與水平Table 1　Factors and levels of response surface experiments

1.2.6松乳菇多糖體外抗氧化活性的測定

1.2.6.1清除DPPH自由基能力的測定采用比色法測定[19-20]。以95%乙醇為溶劑,配制濃度為為1×10-4mol/L的DPPH自由基溶液。分別吸取不同質量濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL)的樣品溶液1.0 mL和3.0 mL DPPH溶液置于試管中,使總體積為4.0 mL,搖勻。反應30 min后在517 nm波長處測定其吸光值(用95%乙醇溶液作為參比)。每個濃度組平行測定3次,求其平均值;以VC作為陽性對照。測定結果以清除率(%)表示,計算公式如下:

式中:AX為3.0 mL DPPH溶液+1.0 mL樣品溶液;AX0為3 mL 95%乙醇+1.0 mL樣品溶液;A0為3.0 mL DPPH溶液+1.0 mL蒸餾水。

1.2.6.2清除OH自由基能力的測定采用Fronton反應體系模型測定[21]。在試管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL,9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL,不同質量濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL)的樣品溶液1.0 mL,立即混勻,最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL開始反應,37 ℃反應30 min,在510 nm波長處測量吸光值(用蒸餾水作為參比)。每個濃度組平行測定3次,求其平均值;以VC作為陽性對照。測定結果以清除率(%)表示,計算公式如下:

式中:AX為1.0 mL FeSO4溶液+1.0 mL水楊酸-乙醇溶液+1.0 mL樣品溶液+1.0 mL H2O2溶液;AX0為1.0 mL FeSO4溶液+1.0 mL水楊酸-乙醇溶液+1.0 mL樣品溶液+1.0 mL蒸餾水;A0為1.0 mL FeSO4溶液+1.0 mL水楊酸-乙醇溶液+1.0 mL蒸餾水+1.0 mL H2O2溶液。

式中:AX為4.5 mL Tris-HCl緩沖液+1.0 mL樣品溶液+0.4 mL鄰苯三酚溶液;AX0為4.5 mL Tris-HCl緩沖液+1.0 mL樣品溶液+0.4 mL蒸餾水;A0為4.5 mL Tris-HCl緩沖液+1.0 mL蒸餾水+0.4 mL鄰苯三酚溶液。

1.2.7數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)使用Excel進行整理和繪圖;同時利用Design-Expert 8.0統(tǒng)計分析軟件進行多元二次回歸模型方程的建立及方差分析,運用該軟件中響應面值優(yōu)化程序求得當響應面值最大時各因素的最佳組合。

2　結果與分析

2.1　單因素實驗

2.1.1提取溫度對松乳菇多糖得率的影響在其他提取條件相同的情況下,比較分析了80、85、90、95、100 ℃不同提取溫度下對多糖提取得率的影響,結果見圖1。從圖1可以看出,剛開始隨著提取溫度的增加,多糖得率增加迅速;當溫度到達90 ℃后,隨著提取溫度的增加,曲線變得平坦,多糖得率緩慢降低。一般來說,提取溫度的提高,就會增加溶劑分子和溶質分子的運動,促進擴散作用,從而有利于提高提取率,但是溫度過高有可能破壞有效成分,降低多糖活性,蛋白質等雜質的提出也將增加,會對后續(xù)處理帶來不便[24]。因此,提取溫度選擇85、90、95 ℃作為中心組合實驗的三個水平。

圖1　溫度對松乳菇多糖提取得率的影響Fig.1　Effect of temperature on the yield of Lactarius deliciosus polysaccharides

2.1.2提取時間對松乳菇多糖得率的影響在其他提取條件相同的情況下,比較分析了1、1.5、2、2.5、3 h不同提取時間對多糖得率的影響,結果見圖2。從圖2可以看出,提取時間在1～2 h范圍內,隨著提取時間的延長,多糖得率逐漸增加;2 h后,隨著提取時間的延長,多糖得率緩慢降低?？赡苁怯捎谠趯嶒灄l件下提取溫度較高,處理時間過長使得粗多糖中的糖蛋白組分緩慢變性析出,加之后期的高速離心使糖蛋白以不溶的沉淀狀物質分離出來;另外隨浸提時間的延長可能還會造成多糖的逐漸降解[25]。因此,提取時間選擇1.5、2、2.5 h作為中心組合實驗的三個水平。

圖2　時間對松乳菇多糖得率的影響Fig.2　Effect of time on the yield of Lactarius deliciosus polysaccharides

2.1.3料液比對松乳菇多糖得率的影響在其他提取條件相同的情況下,比較分析了1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 (mg/mL)不同提取料液比對多糖提取得率的影響,結果見圖3。從圖3可以看出,當料液比在1∶20～1∶30 g/mL范圍內,隨著提取料液比的增加,多糖得率增加迅速;當料液比在1∶30～1∶40 g/mL范圍內,隨著提取料液比的增加,多糖得率減小;這是因為當料液比較小時,隨著水量增多有利于多糖的溶出與擴散,多糖的得率隨之增大;但過高的料液比會導致原料中其他水溶物的溶出,抑制了多糖的提取;綜合考慮提取效率和濃縮工作量。因此,提取料液比選擇1∶25、1∶30、1∶35 g∶mL作為中心組合實驗的三個水平。

圖3　液料比對松乳菇多糖得率的影響Fig.3　Effect of olid-liquid ratio on the yield of Lactarius deliciosus polysaccharides

2.1.4提取次數(shù)對松乳菇多糖得率的影響在其他提取條件相同的情況下,比較分析了1、2、3、4、5次不同提取次數(shù)對多糖提取得率的影響,結果見圖4。從圖4可以看出,當總提取次數(shù)為1次時,多糖得率比較低;隨著提取次數(shù)的增加,多糖得率也隨之增大;當總提取次數(shù)在2～4次范圍時,多糖得率曲線基本趨于平坦,并有下降的趨勢;當總提取次數(shù)為5次時,多糖得率有明顯的下降趨勢,考慮到后期多糖溶液濃縮困難以及節(jié)省能源,因此,提取次數(shù)選擇1、2、3次作為中心組合實驗的三個水平。

圖4　提取次數(shù)對松乳菇多糖得率的影響Fig.4　Effect of times on the yield of Lactarius deliciosus polysaccharides

2.2　響應面優(yōu)化實驗

在單因素實驗結果的基礎上,根據(jù)Box-Benhnken設計原理,以溫度、時間、料液比和提取次數(shù)4個因素為自變量,以松乳菇多糖得率為響應值,采用響應面法進行四因素三水平的實驗設計,共包括29組實驗方案。實驗設計方案及實驗結果見表2,ANOVA分析見表3。

表2　松乳菇多糖得率的響應面法設計方案及實驗結果Table 2　Response surface design arrangement of the yield of Lactarius deliciosus polysaccharides and experimental results

表3　響應面對多糖得率的ANOVA分析Table 3　ANOVA analysis of response surface on the yield of polysaccharides

注：**為差異性極顯著,p<0.01;*為差異性顯著,p<0.05。

2.2.1擬合模型方程的建立與方差分析利用Design-Expert 8.05統(tǒng)計軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析,建立二次響應面回歸模型,并獲得松乳菇多糖得率(Y)的二次多項回歸模型方程如下:

Y=9.98+1.39A+0.22B+0.013C+1.42D-0.14AB+0.15AC+1.76AD+0.44BC-0.087BD-0.33CD-1.45A2-0.57B2-0.19C2-1.99D2。

該二次回歸模型方程的ANOVA分析結果表明(表3):提取溫度A、提取次數(shù)D、交互因素AD(即提取溫度和提取次數(shù)交互作用)、提取溫度的二次項A2、提取次數(shù)的二次項D2的p<0.01,說明這些因素對松乳菇多糖得率有極顯著的影響;提取時間的二次項B2的p<0.05,說明提取時間對松乳菇多糖得率有顯著的影響;其他因素的p>0.05,說明無顯著影響[27]。由此得出4個因素對松乳菇多糖得率的影響程度由大到小依次為:次數(shù)(D)>溫度(A)>時間(B)>料液比(C)。

2.2.2響應面分析根據(jù)回歸模型,利用Design-Expert 8.05軟件繪制響應面分析圖和等高線圖。從響應面分析圖中可以清晰的看出各因素交互作用對松乳菇多糖得率的影響。對松乳菇多糖得率影響越大的因素,其曲線走勢會相對越陡;在等高線圖中,各因素對松乳菇多糖得率的影響體現(xiàn)在其軸向等高線的密集程度上,軸向等高線越密集,說明該因素對松乳菇多糖得率的影響越顯著[28]。通過比較如圖5中響應面分析圖和等高線圖可以看出:提取溫度(A)和提取次數(shù)(D)兩因素之間的交互作用對松乳菇多糖得率的影響具有極顯著性差異,而其他因素兩兩之間的交互作用對松乳菇多糖得率影響不顯著。

圖5　兩因素交互作用對松乳菇多糖得率影響的響應面圖Fig.5　Response surface plots showing the effects of operating parameters on the yield of Lactarius deliciosus polysaccharides

2.2.3最佳條件的確定及驗證實驗通過Design-Expert 8.05軟件分析得到最佳松乳菇多糖提取工藝條件為:提取溫度92.76 ℃、提取時間1.64 h、液料比1∶28.46 (mg/mL)、提取次數(shù)2.87次。結合實際可操作性,調整為:提取溫度92.8 ℃、提取時間1.6 h、液料比1∶28 (mg/mL)、提取次數(shù)3次。此條件下多糖得率為10.41%,模型預測值為10.60%,模型預測值與實測值相比,其相對誤差為1.79%,說明本實驗建立的二次多項回歸方程能夠有效的反應各因素對松乳菇多糖得率的影響,同時也證明了用響應面法優(yōu)化松乳菇多糖得率回歸方程模型是可行的。

2.3　松乳菇多糖體外抗氧化活性測定

2.3.1松乳菇多糖對DPPH自由基的清除能力如圖6所示,松乳菇多糖對DPPH自由基有一定的清除能力;在測定的質量濃度范圍內,隨著松乳菇多糖質量濃度的增加,對DPPH自由基的清除能力也隨之增強;在整個測定的質量濃度范圍內,松乳菇多糖對DPPH自由基的清除能力明顯要低于VC。其中松乳菇多糖和VC的IC50分別為0.855和0.197 mg/mL。

圖6　松乳菇多糖對DPPH自由基的清除率Fig.6　Effect of Lactarius deliciosus polysaccharides on DPPH free radical scavenging

2.3.2松乳菇多糖對OH自由基的清除能力羥自由基被認為是氧化應激損傷主要原因,其很容易穿過細胞膜,與大多數(shù)生物大分子反應,如碳水化合物、蛋白質和DNA[29]。松乳菇多糖對OH自由基清除能力如圖7所示。從圖7可以看出,在測定的質量濃度范圍內,隨著松乳菇多糖和VC質量濃度的增加,對OH自由基的能力也隨著增強;但在相同質量濃度時,松乳菇多糖清除率顯著低于VC,其中松乳菇多糖和VC的IC50分別為1.147和0.287 mg/mL。說明松乳菇多糖中的含有羥基官能團能提供氫質子,從而能夠有效阻止自由基反應,將自由基轉化為無毒的物質[30]。

圖7　松乳菇多糖對OH自由基的清除率Fig.7　Effect of Lactarius deliciosus polysaccharides on hydroxyl free radical scavenging

圖8　松乳菇多糖對自由基的清除率Fig.8　Effect of Lactarius deliciosus polysaccharides on superoxied free radical scavenging

3　結論

通過二次響應面分析[32],獲得松乳菇多糖超聲波輔助提取的最佳條件為:提取溫度92.8 ℃、提取時間1.6 h、液料比1∶28 (mg∶mL)、提取次數(shù)3次。在此優(yōu)化條件下,進行3次重復驗證實驗的平均多糖得率為10.41%,與預測值基本相符,說明經響應面優(yōu)化后的實驗條件具有實際意義;同時,也表明該模型設計合理,對松乳菇多糖的最佳提取工藝具有現(xiàn)實指導作用。

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