一株源自深海沉積物產(chǎn)中溫α-淀粉酶菌株的鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)的研究

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(1.揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,海洋科學(xué)技術(shù)研究所,江蘇揚(yáng)州 225100; 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,河北保定 071001)

α-淀粉酶是能夠隨機(jī)切割α-1,4-糖苷鍵降解淀粉和其他碳水化合物的內(nèi)切酶類(lèi)。α-淀粉酶占據(jù)了工業(yè)酶制劑市場(chǎng)的25%～30%,在淀粉加工、釀造、酒精生產(chǎn)、紡織和其他工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[1]。傳統(tǒng)的淀粉糖化生物工藝通常涉及液化和糖化兩個(gè)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)過(guò)程均在高溫下進(jìn)行:液化所需的溫度為80～90 ℃,而糖化所需的溫度為55～60 ℃[2]。嗜熱α-淀粉酶在節(jié)約成本、溶解底物、降低粘度和減少微生物污染風(fēng)險(xiǎn)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。極端嗜熱菌的最適生長(zhǎng)溫度高于80 ℃,是產(chǎn)生嗜熱α-淀粉酶的重要來(lái)源[3],從而引起了國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。因此,嗜熱α-淀粉酶在淀粉糖化生物工藝方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。發(fā)掘具有新型功能的α-淀粉酶,特別是嗜熱性強(qiáng)的α-淀粉酶,對(duì)于科學(xué)研究以及工業(yè)應(yīng)用都具有重大的研究意義。而由于極端嗜熱α-淀粉酶的最佳活性溫度超出了工業(yè)需求的溫度,所以中度嗜熱α-淀粉酶比極端嗜熱α-淀粉酶在工業(yè)方面具有更大的應(yīng)用價(jià)值。例如,最適溫度在50～65 ℃的α-淀粉酶能夠有效地減少副產(chǎn)品的形成和降低能源需求,在淀粉液化方面比極端嗜熱α-淀粉酶更具有潛在優(yōu)勢(shì)。

大多數(shù)α-淀粉酶來(lái)源于陸地微生物的芽孢桿菌屬,但是從海洋環(huán)境中獲得的α-淀粉酶具有獨(dú)特的性質(zhì),受到越來(lái)越多的關(guān)注。與陸地環(huán)境相比,海洋環(huán)境具有高壓、低溫或高溫(熱液口)、高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)等典型的環(huán)境特征,蘊(yùn)藏著豐富、性質(zhì)獨(dú)特的海洋微生物。深海微生物由于具有獨(dú)特的代謝途徑,從而成為提供新型極端酶的重要資源庫(kù)。目前,已有一些源自深海細(xì)菌α-淀粉酶的報(bào)道:Bacillussp. SCSIO 15121[4-5],Nocardiopsissp. 7326[6],Geobacillussp. 4j[7],Flammeovirgapacifica[8],LuteimonasabyssiXH031[9],Thermotogamaritima[10]和Rhodothermusmarinus[11]。此外,幾種源自深海極端嗜熱古菌火球菌屬和熱球菌屬的嗜熱α-淀粉酶也已經(jīng)被研究[2,12]。這些源自海洋環(huán)境微生物的α-淀粉酶在熱穩(wěn)定性、耐鹽性和pH穩(wěn)定性等方面具有特殊的性質(zhì),不同于源自陸地微生物的α-淀粉酶。最近,Homaei等人綜述了源自海洋微生物的淀粉酶[13];Hiteshi和Gupta探討了α-淀粉酶的熱適應(yīng)性機(jī)制[14]。

本文從西南印度洋洋中脊非活動(dòng)熱液區(qū)的深海沉積物中分離出一株能夠有效地降解淀粉的菌株,研究其生長(zhǎng)的最適溫度和最適pH,并對(duì)其所產(chǎn)生的α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究,為淀粉糖化過(guò)程中進(jìn)行淀粉的降解提供了深海微生物資源。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

深海沉積物樣本編號(hào)為DY11-15-20 TVG11,是由大洋一號(hào)于2009年1月巡航期間,在西南印度洋洋中脊通過(guò)電視捕獲取樣器在1985 m水深處收集得到;蛋白胨及酵母提取物分析純,英國(guó)OXOID公司;基因組提取試劑盒美國(guó)Omega Bio-tek公司;2×Taq PCR MasterMix美國(guó)New England Biolab公司;淀粉分析純,美國(guó)Sigma公司;Tris、甘氨酸分析純,美國(guó)AMRESCO公司;氯化鈉、氯化鉀、瓊脂粉、碘、碘化鉀、醋酸、磷酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、戊二醛、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、乙醇、3,5-二硝基水楊酸、苯酚分析純,中國(guó)國(guó)藥集團(tuán);稀釋LB 培養(yǎng)基蛋白胨1.0 g,酵母提取物0.5 g,氯化鈉1.0 g,并加入人工海鹽將鹽度調(diào)到35‰;完全溶解后,1×105Pa濕熱滅菌20 min。

THZ-92 C恒溫振蕩器上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;SHP-160型生化培養(yǎng)箱上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;722可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)上海菁華科技儀器有限公司;S-4800電子顯微鏡日本日立公司;C1000 Touch PCR 儀美國(guó)Bio-Rad公司;Heraeus Pico17微型臺(tái)式離心機(jī)美國(guó)Thermo Fisher 公司;FE20pH計(jì)梅特勒-托利多儀器(上海)公司;CT15RE臺(tái)式微量高速離心機(jī)日本HITACHI公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1淀粉降解菌的篩選稱(chēng)取0.5 g深海沉積物樣本,接種到20 mL稀釋LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。取新鮮培養(yǎng)物,劃線(xiàn)接種于稀釋LB 固體培養(yǎng)基,倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取生長(zhǎng)較好的單菌落,進(jìn)一步劃線(xiàn)分離純化3～4次。將多次劃線(xiàn)分離得到的單菌落,接種于稀釋LB培養(yǎng)基,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。分別取2 μL培養(yǎng)物接種在含有1%可溶性淀粉的稀釋LB培養(yǎng)基平板上,過(guò)夜培養(yǎng)。碘液染色5 min,輕輕倒去碘液,菌落周?chē)纬赏该魅Φ木昙礊槟軌蚪到獾矸鄣木辍＿x取形成透明圈最大的菌株,命名為T(mén)VG11-1,進(jìn)行后續(xù)的研究。

1.2.2菌株TVG11-1的形態(tài)鑒定將菌株TVG11-1接種到35‰鹽度的稀釋LB液體培養(yǎng)基中,在最適溫度45 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6。取1 mL菌液至無(wú)菌1.5 mL離心管,8000 r/min離心5 min,去上清。取無(wú)菌去離子水重懸洗滌細(xì)胞,重復(fù)兩次,使用2.5%戊二醛在4 ℃溫度下固定樣品2 h。取1 mL 0.1 mol/L PBS緩沖液重懸洗滌細(xì)胞,重復(fù)三次,分別使用30%、50%、70%、80%、90%及100%乙醇對(duì)樣品進(jìn)行梯度脫水,每個(gè)梯度加入乙醇后靜置10 min。經(jīng)過(guò)臨界點(diǎn)干燥和噴金處理后,通過(guò)掃描電鏡對(duì)菌株TVG11-1的形態(tài)學(xué)特征包括細(xì)胞形態(tài),大小和表面紋理進(jìn)行分析。

1.2.3菌株TVG11-1最適生長(zhǎng)溫度和pH的確定將過(guò)夜活化的菌株TVG11-1按1%接種量接種到35‰鹽度的稀釋LB液體培養(yǎng)基中。選擇30～80 ℃溫度范圍,振蕩培養(yǎng)6 h。通過(guò)測(cè)定不同溫度條件下菌株TVG11-1培養(yǎng)物在600 nm處吸光度值,以確定其最適生長(zhǎng)溫度。

選擇不同緩沖體系(濃度20 mmol/L):pH5.0和pH5.5(醋酸-乙酸鈉體系),pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.5(磷酸鈉-氫氧化鈉體系),pH8.0和pH8.5(Tris-鹽酸體系),pH9.0和pH9.5(甘氨酸-氫氧化鈉體系),對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH進(jìn)行調(diào)整。45 ℃振蕩培養(yǎng)6 h,通過(guò)測(cè)定不同pH條件下菌株TVG11-1培養(yǎng)物在600 nm處吸光度值,以確定其最適生長(zhǎng)pH。

1.2.4菌株TVG11-1的分子生物學(xué)鑒定在最適溫度45 ℃和pH7.0條件下,培養(yǎng)菌株TVG11-1 18 h。取2 mL過(guò)夜培養(yǎng)物,利用OMEGA基因組提取試劑盒提取菌株TVG11-1的基因組DNA。以菌株TVG11-1的基因組DNA為模板,以gyrB-F(5′-TTG RCG GHR GYG GHT ATA AAG T-3′)和gyrB-R(5′-TCC DCC STC AGA RTC WCC CTC-3′)為引物,進(jìn)行g(shù)yrB基因的PCR擴(kuò)增[15]。PCR反應(yīng)體系為25 μL:12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix,0.2 μmol/L的正向引物和反向引物,10 ng基因組DNA。PCR程序?yàn)?95 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s 共35個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,并且由生工生物技術(shù)有限公司(中國(guó)上海)進(jìn)行測(cè)序。

通過(guò)BLAST,檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與菌株TVG11-1的gyrB基因序列相似的序列。選取具有95%相似性的序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用CLUSTAL X 2.0對(duì)相似性最近的芽孢桿菌屬序列進(jìn)行多重比對(duì)[16]。以相似性低、部分注釋的芽孢桿菌gyrB基因序列作為外群。采用鄰接法和最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[17],bootstrap設(shè)為1000次。

1.2.5粗酶液制備和酶活分析取不同條件下菌株TVG11-1的培養(yǎng)物,進(jìn)行冷凍離心(4 ℃,10000 r/min,20 min),取上清液作為粗酶液。

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[18],測(cè)定淀粉水解過(guò)程中還原糖的產(chǎn)量,從而進(jìn)行α-淀粉酶活力的分析。反應(yīng)體系為2 mL:1.5 mL 1.0%的可溶性淀粉和0.5 mL的粗酶液。在不同條件下進(jìn)行反應(yīng),加入2 mL DNS,終止反應(yīng),混勻后100 ℃下加熱10 min。反應(yīng)物冷卻至室溫后測(cè)定540 nm處的OD值。α-淀粉酶的活力單位定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值,并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.6菌株TVG11-1的生長(zhǎng)溫度對(duì)α-淀粉酶產(chǎn)量的影響將過(guò)夜活化后的菌株TVG11-1按1%的比例接種到pH7.0,鹽度為35‰的稀釋LB液體培養(yǎng)基,在不同溫度下(25、30、40、45、50、55、60 ℃)過(guò)夜培養(yǎng)18 h。按照上述方法制備粗酶液,測(cè)定α-淀粉酶活性,從而分析菌株TVG11-1的生長(zhǎng)溫度對(duì)α-淀粉酶產(chǎn)量的影響。

1.2.7淀粉含量對(duì)于菌株TVG11-1α-淀粉酶產(chǎn)量的影響將過(guò)夜活化菌株TVG11-1,分別接種到含有不同可溶性淀粉含量(0.2%～1.0%)并且鹽度為35‰的稀釋LB液體培養(yǎng)基中,在最適溫度和pH的條件下過(guò)夜培養(yǎng)18 h。按照上述方法制備粗酶液,測(cè)定α-淀粉酶活性,計(jì)算相對(duì)酶活,從而確定淀粉含量對(duì)菌株TVG11-1α-淀粉酶產(chǎn)量的影響。相對(duì)酶活計(jì)算公式,如式(1):

相對(duì)酶活力(%)=不同淀粉濃度實(shí)驗(yàn)組測(cè)得OD540值/不含淀粉實(shí)驗(yàn)組測(cè)得OD540值×100

式(1)

1.2.8菌株TVG11-1的生長(zhǎng)周期與α-淀粉酶產(chǎn)量關(guān)系將過(guò)夜活化后的菌株TVG11-1在最適溫度和pH的條件下,按1%的比例接種到pH7.0,鹽度為35‰的LB稀釋液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)。通過(guò)測(cè)定菌株TVG11-1培養(yǎng)物在不同時(shí)間(2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0、13.0、14.5 h)的OD600值,繪制其生長(zhǎng)曲線(xiàn)。每次取樣測(cè)定菌液OD600時(shí),按照上述方法制備粗酶液,測(cè)定α-淀粉酶活性,從而確定菌株TVG11-1的生長(zhǎng)周期與α-淀粉酶產(chǎn)量的關(guān)系。

1.2.9反應(yīng)溫度對(duì)菌株TVG11-1α-淀粉酶活性的影響將菌株TVG11-1在最適溫度和pH的條件下,過(guò)夜培養(yǎng)18 h。按照上述方法制備粗酶液,測(cè)定在pH7.0時(shí),菌株TVG11-1α-淀粉酶在35～85 ℃的酶活,從而確定該酶的最適反應(yīng)溫度。使用以下緩沖液(終濃度為20 mmol/L)調(diào)整反應(yīng)的pH:pH5.0和pH5.5(醋酸-乙酸鈉體系),pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.5(磷酸鈉-氫氧化鈉體系),pH8.0和pH8.5(Tris-鹽酸體系),pH9.0和pH9.5(甘氨酸-氫氧化鈉體系),然后進(jìn)行菌株TVG11-1α-淀粉酶酶活力分析,計(jì)算相對(duì)酶活,從而確定該酶酶活的最適pH。相對(duì)酶活計(jì)算公式,如式(2):

式(2)

1.2.10反應(yīng)pH對(duì)菌株TVG11-1α-淀粉酶活性的影響將菌株TVG11-1在最適溫度和pH的條件下,過(guò)夜培養(yǎng)18 h。按照上述方法制備粗酶液,測(cè)定在最適溫度下,菌株TVG11-1α-淀粉酶在pH在5.0～9.5條件下酶活,從而確定該酶的最適反應(yīng)pH。使用以下緩沖液(終濃度為20 mmol/L)調(diào)整反應(yīng)的pH:pH5.0和pH5.5(醋酸-乙酸鈉體系),pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.5(磷酸鈉-氫氧化鈉體系),pH8.0和pH8.5(Tris-鹽酸體系),pH9.0和pH9.5(甘氨酸-氫氧化鈉體系)。相對(duì)酶活計(jì)算同式(2)。

1.3　數(shù)據(jù)處理

采用Excel處理數(shù)據(jù),計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差;利用CLUSTAL X 2.0軟件進(jìn)行序列多重比對(duì),并用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　菌株TVG11-1的特征

通過(guò)劃線(xiàn)分離獲得多株可降解淀粉的菌株,其中TVG11-1菌落生長(zhǎng)最快,菌落最大。菌株TVG11-1革蘭氏染色呈陽(yáng)性,在電子顯微鏡觀(guān)察下呈桿狀(圖1A)。對(duì)含有淀粉的瓊脂培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)的TVG11-1菌落,使用革蘭氏碘溶液染色后,能夠觀(guān)察到明顯的透明圈(圖1B),表明菌株TVG11-1能夠產(chǎn)生水解淀粉的α-淀粉酶。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),菌株TVG11-1的最適生長(zhǎng)溫度為45 ℃(圖2A),最適生長(zhǎng)pH為7.0(圖2B)。菌株TVG11-1已保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)菌種保藏中心(編號(hào)ACCC19897)。

圖1　菌株TVG11-1的電鏡照片(A)及其在含有淀粉的平板上形成的透明圈(B)Fig.1　Scanning electron micrograph of the strain TVG11-1(A)and its clear zone in starch agar-iodine plate(B)

圖3　菌株TVG11-1與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3　Phylogenetic tree of the strain TVG11-1 and its relatives注:括號(hào)內(nèi)為GenBank登錄號(hào);線(xiàn)段0.05表示序列差異的分支長(zhǎng)度;發(fā)育樹(shù)節(jié)點(diǎn)的數(shù)值表示Bootstrap值。

根據(jù)上海生工分析測(cè)序結(jié)果,菌株TVG11-1包含了894個(gè)核苷酸的gyrB基因序列,已被遞交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為KX265578。用BLAST程序,對(duì)菌株TVG11-1的gyrB基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄的其他相似序列進(jìn)行核酸序列同源性比較。選取了17個(gè)具有代表性的gyrB基因序列用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),其中10條序列與KX265578的相似度在98%以上,其余7條序列與KX265578同源性在90%。所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)表明,在這18個(gè)gyrB基因序列組成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中,菌株TVG11-1(KX265578)與解淀粉酶芽孢桿菌聚在一個(gè)分支,該分支的支持率為100%,因此本文將菌株TVG11-1確定為解淀粉酶芽孢桿菌。關(guān)于解淀粉酶芽孢桿菌的產(chǎn)α-淀粉酶條件已有相關(guān)研究[19-22];也有利用分子技術(shù)對(duì)來(lái)自該菌α-淀粉酶進(jìn)行分離,進(jìn)一步對(duì)其結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的相關(guān)報(bào)道[23-26]。

圖2　菌株TVG11-1生長(zhǎng)的最適溫度(A)及最適pH(B)Fig.2　The optimal temperature(A) and pH(B)of strain TVG11-1

2.2　不同溫度對(duì)TVG11-1 α-淀粉酶產(chǎn)量的影響

如圖4所示,隨著溫度的增加,菌株TVG11-1的OD600值和其α-淀粉酶的OD540值均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),表明菌株的生長(zhǎng)量與其α-淀粉酶的產(chǎn)量相吻合。在培養(yǎng)溫度為40 ℃時(shí),菌株TVG11-1α-淀粉酶產(chǎn)量最高,而在該菌株最適生長(zhǎng)溫度45 ℃時(shí),其α-淀粉酶產(chǎn)量減少。由此可見(jiàn),40 ℃是菌株TVG11-1產(chǎn)生α-淀粉酶的最適溫度,不同于該菌株的最適生長(zhǎng)溫度(45 ℃)。

圖4　菌株TVG11-1的生長(zhǎng)溫度對(duì)其α-淀粉酶產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of growth temperature of the strain TVG11-1 on α-amylase production

2.3　淀粉含量對(duì)菌株TVG11-1 α-淀粉酶產(chǎn)量的影響

如圖5所示,與不加可溶性淀粉的對(duì)照組相比,培養(yǎng)基中加入0.2%的可溶性淀粉時(shí),菌株TVG11-1α-淀粉酶的產(chǎn)量最高,并隨著可溶性淀粉含量的增加,該酶的產(chǎn)量逐漸減少。當(dāng)培養(yǎng)基中含有0.8%和1%可溶性淀粉時(shí),菌株TVG11-1α-淀粉酶的產(chǎn)量要低于不加淀粉的對(duì)照組的產(chǎn)量。由此可見(jiàn),菌株TVG11-1α-淀粉酶是一種不依賴(lài)于淀粉底物誘導(dǎo)的胞外酶。Konsula和Liakopoulou-Kyriakides研究了枯草芽孢桿菌產(chǎn)中溫α-淀粉酶,結(jié)果表明該酶也是不依賴(lài)淀粉底物誘導(dǎo)[21],與本研究的結(jié)果相一致。

圖5　淀粉含量對(duì)菌株TVG11-1 α-淀粉酶產(chǎn)量的影響Fig.5　Effect of soluble starch contents on the TVG11-1 α-amylase activity

2.4　菌株TVG11-1的生長(zhǎng)周期與其α-淀粉酶活性的關(guān)系

為了分析菌株TVG11-1的生長(zhǎng)周期與其α-淀粉酶活性的關(guān)系,測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的培養(yǎng)物的OD600值和α-淀粉酶活性。如圖6所示,菌株TVG11-1α-淀粉酶的活性在培養(yǎng)時(shí)間為9 h時(shí)達(dá)到最大值(122.7 U/mL),而該菌株處于指數(shù)生長(zhǎng)期。當(dāng)菌株TVG11-1處于指數(shù)生長(zhǎng)期后期,隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),菌株TVG11-1α-淀粉酶活性逐漸下降。由此,菌株TVG11-1α-淀粉酶的活性時(shí)間進(jìn)程曲線(xiàn)與該菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)趨勢(shì)總體相符。

圖6　菌株TVG11-1的生長(zhǎng)曲線(xiàn)與其α-淀粉酶活性的關(guān)系Fig.6　Relationship between growth curve of the strain TVG11-1 and its α-amylase activity

2.5　反應(yīng)溫度對(duì)菌株TVG11-1 α-淀粉酶活性的影響

如圖7所示,菌株TVG11-1α-淀粉酶在35～85 ℃內(nèi)均有活性。隨著溫度從35 ℃升高到60 ℃,菌株TVG11-1α-淀粉酶活性也隨之增加。然而,當(dāng)溫度從60 ℃繼續(xù)升高至80 ℃時(shí),該α-淀粉酶的活性呈下降趨勢(shì)。因此,60 ℃是菌株TVG11-1α-淀粉酶反應(yīng)的最適溫度。

圖7　反應(yīng)溫度對(duì)菌株TVG11-1 α-淀粉酶活性的影響Fig.7　Effect of reaction temperature on the TVG11-1 α-amylase

菌株TVG11-1α-淀粉酶活性的最適溫度(60 ℃)不同于該菌株的最適生長(zhǎng)溫度(45 ℃)。與本研究結(jié)果相一致的相關(guān)研究已有很多報(bào)道,例如,Igarashi等人所分離出一株芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃,但該菌株所產(chǎn)生的α-淀粉酶在55 ℃時(shí)具有最大的酶活性[27]。同樣,Sodhi等人發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌PS-7的最適生長(zhǎng)溫度(37 ℃)也不同于其α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度(60 ℃)[28]。類(lèi)似的結(jié)果還存在于枯草芽孢桿菌TN106(pAT 5)[29]和鏈霉菌IMD 267[30]。但是,有些芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度與其α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度相同[31-32]。因此,菌株的最適生長(zhǎng)溫度與其產(chǎn)生的α-淀粉酶最適反應(yīng)溫度是否相同,可能與菌株的生存環(huán)境相關(guān)。

2.6　反應(yīng)pH對(duì)菌株TVG11-1 α-淀粉酶活性的影響

不同反應(yīng)pH對(duì)TVG11-1菌株α-淀粉酶活性的影響,如圖8所示,菌株TVG11-1α-淀粉酶在pH5.5～9.0范圍內(nèi)有活性,而當(dāng)pH小于5.0時(shí),該菌株α-淀粉酶無(wú)法降解淀粉。隨著pH的增加,菌株TVG11-1α-淀粉酶的活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)pH為6.5時(shí),菌株TVG11-1α-淀粉酶的活性最高,因此該酶的最適反應(yīng)pH為6.5。這些結(jié)果表明,菌株TVG11-1α-淀粉酶在中性pH附近活性較高,在酸性條件下活性幾乎消失,但在偏堿性環(huán)境下仍具有40%以上相對(duì)酶活性。在最適條件下培養(yǎng)9 h,該酶平均酶活力為122.7 U/mL。

圖8　反應(yīng)pH對(duì)菌株TVG11-1 α-淀粉酶活性的影響Fig.8　Effect of the reaction pH on the TVG11-1 α-amylase

與其他芽孢桿菌所產(chǎn)生的α-淀粉酶最適pH相比,菌株TVG11-1α-淀粉酶與已報(bào)道的枯草芽孢桿菌、深海芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌NH1所產(chǎn)生的α-淀粉酶的最適反應(yīng)pH相同[21,33-34]。然而,芽孢桿菌GM8901和芽孢桿菌TS-23所產(chǎn)生的α-淀粉酶具有相同的最適反應(yīng)溫度,但是它們的最適反應(yīng)pH不同于菌株TVG11-1α-淀粉酶。芽孢桿菌種GM8901α-淀粉酶在pH11.0～12.0時(shí)表現(xiàn)出了最強(qiáng)活性[35],而芽孢桿菌種TS-23α-淀粉酶的最適pH為9[36]。另外,菌株TVG11-1α-淀粉酶與源自其它海洋微生物的α-淀粉酶具有相似的最適pH以及相同的最適溫度[37-39]。與上述研究結(jié)果不同的是,芽孢桿菌Bacillussp.Ferdowsicous的α-淀粉酶在pH低至4.5時(shí),該酶仍具有最強(qiáng)的活性[40]。因此,源自不同環(huán)境的微生物所產(chǎn)生的α-淀粉酶在pH的適應(yīng)性方面存在著差異性。

3　結(jié)論

本文首次從西南印度洋洋中脊非活動(dòng)熱液區(qū)的深海沉積物中分離出一株能夠有效降解淀粉的菌株TVG11-1。通過(guò)電鏡和分子生物學(xué)鑒定,該菌株為解淀粉芽孢桿菌。菌株TVG11-1最適的生長(zhǎng)溫度和pH分別為45 ℃和pH7.0,其所產(chǎn)生的α-淀粉酶是一種不依賴(lài)淀粉底物的胞外中溫淀粉酶,其最適反應(yīng)溫度為60 ℃,最適反應(yīng)pH為6.5。在最適條件下培養(yǎng)9 h,該酶平均酶活力為122.7 U/mL,高于王磊[41]分離于芽孢桿菌的α-淀粉酶(6.4～10.4 U/mL);同時(shí)高于來(lái)源于ThermococcussiciuliHJ21[42]的高溫酸性α-淀粉酶(19.6 U/mL)。作為分離自熱液區(qū)菌株的α-淀粉酶,不僅具有對(duì)高溫的耐受性,還具有中溫的最適反應(yīng)溫度,在輕工業(yè)節(jié)能生產(chǎn)方面有較大的應(yīng)用價(jià)值。本研究分離獲得的菌株TVG11-1為食品工業(yè)降解淀粉提供了菌種資源,其對(duì)淀粉降解能力的基因資源有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。

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