香圓枳殼柚皮苷的提取及其對(duì)亞硝酸鹽的清除作用

，　

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000)

枳殼(FructusAurantii)為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)、代代花(C.a.var.amara)、香圓(Citruswilsonii)及其枸櫞(Poncirustrifoliata)的干燥幼果與未成熟果實(shí)[1]。香圓枳殼始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其性苦、辛、酸、溫,具有理氣寬中、行滯消脹的功效[2],主治胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、胃下垂、脫肛、子官脫垂等病癥,為歷版《中國藥典》所收載[3],也是國家衛(wèi)生部所頒布的可用于保健食品的原料[4]?，F(xiàn)代研究表明,香圓枳殼的主要成分為黃酮類物質(zhì)、生物堿以及揮發(fā)油類[5-6]。其中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷是香圓枳殼中的的主要黃酮類物質(zhì),黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、抑菌抗炎、抗過敏等多種生物活性[7-8],因而在功能保健食品開發(fā)中應(yīng)用廣泛[9]。然而關(guān)于香圓枳殼柚皮苷的研究報(bào)道很少,尤其缺乏復(fù)合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷及其清除亞硝酸鹽的研究[10-13]。因此,采用復(fù)合酶法從香圓枳殼中提取柚皮苷并研究其亞硝酸鹽的清除作用,不僅可充分利用當(dāng)?shù)氐南銏A資源,增加香圓產(chǎn)業(yè)的附加值,而且可為香圓枳殼柚皮苷的工業(yè)化開發(fā)提供理論支持。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

枳殼香圓的干燥幼果,50 ℃干燥,粉碎備用,購于漢中中藥材批發(fā)市場(chǎng);柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品中國藥品生物制品鑒定所;果膠酶(4000 U/mg)、纖維素酶(10000 U/mg)和氏璧生物技術(shù)有限公司;乙醇、甲醇、HCl、NaOH、硫酸、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺等均為分析純。

ZN-02粉粹機(jī)北京興時(shí)利和科技有限公司;TU-1221紫外-可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器公司;QCD6150數(shù)控超聲清洗器天津恒瑞機(jī)電設(shè)備有限公司;TDL-40B離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;AL204電子天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司;DHF-9055A電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科技有限公司;RE5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1復(fù)合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷工藝流程

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)精密稱取5.00 g原料,加入一定質(zhì)量的果膠酶和纖維素酶(質(zhì)量比1∶1)的復(fù)合酶,在一定pH,溫度45 ℃條件下超聲處理,提取液離心(3000 r/min,20 min)后取上清液,進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算柚皮苷得率。分別考察pH(超聲時(shí)間30 min,超聲功率300 W,加酶量120 μg/g條件下,pH分別為3、4、5、6、7、8);超聲時(shí)間(pH6,超聲功率300 W,加酶量120 μg/g條件下,超聲時(shí)間分別為20、25、30、35、40、45 min);超聲功率(pH6,超聲時(shí)間30 min,加酶量120 μg/g條件下,超聲功率分別為100、150、200、250、300、350 W);加酶量(pH6,超聲時(shí)間30 min,超聲功率300 W條件下,加酶量分別為80、100、120、140、160、180 μg/g)等因素對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果的影響。

1.2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選取pH、超聲時(shí)間、超聲功率和加酶量為考察對(duì)象,以柚皮苷得率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析。研究各因素對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果的影響,實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　響應(yīng)面分析因素與水平Table 1　Factors and levels of response surface analysis

1.2.4柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg,甲醇充分溶解并定容至100 mL,再分別準(zhǔn)確吸取上述貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,由于柚皮苷在Al(NO3)3溶液中能形成黃色絡(luò)合物,在最大吸收峰波長(zhǎng)420 nm處測(cè)吸光度,可得吸光度A與柚皮苷濃度C(μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.013X+0.0657,R2=0.9983,X為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,Y為吸光度。

1.2.5柚皮苷得率的測(cè)定精密稱取5.00 g原料,按照方法“1.2.1”進(jìn)行香圓枳殼柚皮苷的提取,制的柚皮苷的提取液并定容,按照方法“1.2.4”于420 nm處測(cè)其吸光度,根據(jù)柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算柚皮苷濃度,并按下式計(jì)算香圓枳殼柚皮苷的得率:

得率(%)=(C×N×V/W×100)×100

式中,C為樣液中柚皮苷濃度,μg/mL;N為提取液的稀釋倍數(shù),50;V為粗提液體積,mL;W為香圓枳殼粉質(zhì)量,g[17-19]。

1.2.6柚皮苷對(duì)亞硝酸鹽的清除作用參照劉鋼等[20]方法進(jìn)行修改。比色管中分別加入2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、一定量的香圓枳殼柚皮苷提取液,混合均勻,之后加入2 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液混勻,靜置5 min,加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液,混勻后靜置15 min,加蒸餾水定容至50 mL,測(cè)定538 nm波長(zhǎng)處吸光度(A樣品),同時(shí)以蒸餾水代替亞硝酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)測(cè)定吸光度(A樣空),以蒸餾水代替香圓枳殼柚皮苷提取液的空白對(duì)照測(cè)定吸光度(A對(duì)照)。以茶多酚為陽性對(duì)照。亞硝酸鹽清除率按下式計(jì)算:

1.3　數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值,利用Design Expert V 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,建立數(shù)學(xué)模型。

2　結(jié)果與分析

2.1　復(fù)合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷工藝優(yōu)化

2.1.1不同pH對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響由圖1可以看出,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),香圓枳殼柚皮苷得率隨著pH增大先升高,到達(dá)最高點(diǎn)后呈緩慢下降趨勢(shì),在pH為6時(shí),香圓枳殼柚皮苷提取效果較好,這是因?yàn)榇藭r(shí)酸堿性環(huán)境最適合復(fù)合酶作用于原料,如果pH繼續(xù)上升,則酶的空間結(jié)構(gòu)就會(huì)受到影響,導(dǎo)致其活性下降[21]。

圖1　不同pH對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.1　Effect of different pH on naringin extraction from Fructus Aurantii

2.1.2不同超聲時(shí)間對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響由圖2可以看出,隨著超聲處理時(shí)間的增加,香圓枳殼柚皮苷得率會(huì)逐漸提高。在超聲時(shí)間為35 min時(shí),枳殼柚皮苷得率達(dá)到最高水平,如果大于35 min時(shí),枳殼柚皮苷得率會(huì)開始下降,這可能是因?yàn)樵谳^長(zhǎng)超聲波時(shí)間作用下,枳殼柚皮苷會(huì)分解[18]。因此,超聲波時(shí)間為35 min時(shí),枳殼柚皮苷提取效果較好。

圖2　不同超聲波時(shí)間對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.2　Effect of different ultrasonic time on naringin extraction from Fructus Aurantii

2.1.3不同超聲功率對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響由圖3可以看出,當(dāng)超聲波功率上升后,枳殼柚皮苷得率也會(huì)相應(yīng)提高,當(dāng)超聲波功率達(dá)到250 W時(shí),枳殼柚皮苷得率上升到峰值,隨著超聲波功率繼續(xù)上升,枳殼柚皮苷得率會(huì)大幅減少。這是因?yàn)槌暡üβ噬仙?復(fù)合酶活性相應(yīng)下降,枳殼柚皮苷得率相應(yīng)下降[22-23]。因此,超聲波功率為250 W時(shí),枳殼柚皮苷提取效果較好。

圖3　不同超聲波功率對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.3　Effect of different ultrasonic power on naringin extraction from Fructus Aurantii

圖4　不同加酶量對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響 Fig.4　Effect of different enzyme dosage on naringin extraction from Fructus Aurantii

2.1.4不同加酶量的提取效果由圖4可以看出,隨著加酶量增長(zhǎng)枳殼柚皮苷得率相應(yīng)增大,當(dāng)加酶量達(dá)到120 μg/g后,加酶量繼續(xù)增大,枳殼柚皮苷得率反而有所下降,這主要是因?yàn)榧用噶恳呀?jīng)達(dá)到了飽和狀態(tài);如果加酶量繼續(xù)增大,枳殼柚皮苷得率波動(dòng)范圍較小[24]。因此加酶量為120 μg/g時(shí),枳殼柚皮苷提取效果較好。

2.1.5復(fù)合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析復(fù)合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷的條件可知,pH、超聲波時(shí)間、超聲波功率、加酶量這4個(gè)因素都是顯著因素。得率的二次回歸擬合方程如下:

得率(%)=3.20-0.32A-0.19B-0.42C+0.28D+0.14AB+0.22AC-0.38AD+0.14BC-0.36BD-0.17CD-0.64A2-0.44B2-0.56C2-0.23D2。回歸方程中二次項(xiàng)的系數(shù)均為負(fù)數(shù),說明回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn),即極大值點(diǎn)。

表2　復(fù)合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Response surface experiment results of composite enzyme assisted extraction of naringin from Citrus wilsonii Fructus Aurantii

表3　回歸方程各項(xiàng)的方差Table 3　Variance of regression equation

注：* 差異顯著,p<0.05,**差異極顯著,p<0.01。

圖5　pH和超聲波時(shí)間相互作用對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.5　Effect of pH and ultrasonic time on extraction of naringin from Fructus Aurantii

圖7　pH和加酶量相互作用對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.7　Effect of pH and enzyme dosage on extraction of naringin from Fructus Aurantii

圖8　超聲波時(shí)間和超聲波功率相互作用對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.8　Effect of ultrasonic time and ultrasonic power on extraction of naringin from Fructus Aurantii

圖9　超聲波時(shí)間和加酶量相互作用對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.9　Effect of ultrasonic time and enzyme dosage on extraction of naringin from Fructus Aurantii

圖10　超聲波功率和加酶量相互作用對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.10　Effect of ultrasonic power and enzyme dosage on extraction of naringin from Fructus Aurantii

響應(yīng)曲面傾斜度大小表示相關(guān)因素的交互影響大小，圖5～圖10表示A、B、C、D四個(gè)因素之間的交互作用對(duì)香圓枳殼柚皮苷得率的影響。由圖5～圖10及p值分析可以看出，pH和超聲波時(shí)間、pH和超聲波功率、pH和加酶量、超聲波時(shí)間和超聲波功率、超聲波時(shí)間和加酶量、超聲波功率和加酶量對(duì)香圓枳殼柚皮苷得率的兩兩交互作用明顯，與方差分析結(jié)果一致。得到復(fù)合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷的最佳條件為pH5.32，超聲波時(shí)間32.27 min，超聲波功率230.16 W，加酶量134.31 μg/g，在此工藝條件下，軟件程序?qū)ο銏A枳殼柚皮苷得率的預(yù)測(cè)值為3.81%。

2.1.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性，將復(fù)合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷的最佳提取條件調(diào)整為：pH5.3，超聲波時(shí)間32 min，超聲波功率230 W，復(fù)合酶添加量134 μg/g，在此工藝條件下，進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，香圓枳殼柚皮苷的得率為3.75%，RSD為1.16%(n=5)，表明響應(yīng)面建立的復(fù)合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷數(shù)學(xué)模型對(duì)香圓枳殼柚皮苷提取穩(wěn)定可靠，能指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

圖11　香圓枳殼柚皮苷對(duì)亞硝酸鹽清除率影響Fig.11　Effect of naringin from Fructus Aurantii on clearance to nitrite

2.2　香圓枳殼柚皮苷對(duì)亞硝酸鹽的清除作用

由圖11可知,隨著香圓枳殼柚皮苷和茶多酚濃度增大,香圓枳殼柚皮苷和茶多酚對(duì)亞硝酸鹽清除能力均逐漸增強(qiáng),當(dāng)香圓枳殼柚皮苷濃度小于或等于1 mg/mL時(shí),其清除亞硝酸鹽的能力小于茶多酚,當(dāng)香圓枳殼柚皮苷濃度大于1 mg/mL時(shí),其清除亞硝酸鹽的能力增強(qiáng)得較快,對(duì)亞硝酸鹽的清除率大于茶多酚,當(dāng)香圓枳殼柚皮苷濃度達(dá)到3 mg/mL,其對(duì)亞硝酸鹽的清除率可達(dá)到91.1%。

3　結(jié)論

為充分利用香圓枳殼資源,本實(shí)驗(yàn)以香圓枳殼為原料,采用果膠酶和纖維素酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷,對(duì)其最佳提取工藝進(jìn)行探討,響應(yīng)面優(yōu)化香圓枳殼柚皮苷提取實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛯?shí)際情況擬合度比較好,復(fù)合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷的最佳工藝條件為pH5.3,超聲時(shí)間32 min,超聲功率230 W,加酶量134 μg/g。在此工藝條件下,香圓枳殼柚皮苷實(shí)際得率為3.75%。

香圓枳殼柚皮苷對(duì)亞硝酸鹽的清除實(shí)驗(yàn)表明:隨著濃度增大,香圓枳殼柚皮苷對(duì)亞硝酸鹽清除能力逐漸增強(qiáng),當(dāng)香圓枳殼柚皮苷濃度達(dá)到3 mg/mL,其對(duì)亞硝酸鹽的清除率可達(dá)到91.1%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為香圓枳殼的綜合開發(fā)利用提供新的思路,為開發(fā)亞硝酸鹽天然清除劑提供理論支持。

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