石榴籽多酚的體外抗氧化活性

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(1.陜西學(xué)前師范學(xué)院生物工程研究所,陜西西安 710100; 2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062; 3.陜西師范大學(xué)食品加工副產(chǎn)物深度開發(fā)與高值化利用重點實驗室,陜西西安 710062)

石榴(PunicagranatumL.)是石榴科石榴屬的一種落葉灌木或小喬木,是一種藥食兩用植物。石榴花萼可做成味道鮮美的菜肴;石榴葉富含活性成分,可作保健茶,亦可做藥,敷于患處有治跌打損傷的療效;石榴根皮入藥雖苦澀,但具有殺蟲澀腸、治中耳炎、愈傷止血及明目之功效。石榴果實不僅味道鮮美,還營養(yǎng)豐富,有“九州神果”之美譽。石榴果皮也是一味良藥,不僅有殺蟲、收斂之功能,在近年的科學(xué)研究中還發(fā)現(xiàn)其活性成分提取物具有抗癌等作用。石榴籽約占石榴全重20%,對人體也有一定的益處,可治療厭食、胃寒、脘脹等,對石榴籽的相關(guān)研究顯示,石榴籽中纖維素最多,約含58.76%,其次是脂肪酸,蛋白質(zhì);此外,石榴籽中還含有約0.7%～1.2%多酚類物質(zhì),石榴籽的生物活性與這些功能性成分有著密切關(guān)系[1-6]?？梢?石榴全身上下都是寶。

然而,人們對石榴籽這一寶貴資源認(rèn)知不足,大量的石榴籽在加工中被直接遺棄[7]。近年來,隨著科學(xué)技術(shù)進(jìn)步,對石榴籽的研究越來越受到重視,關(guān)于石榴籽活性物質(zhì)的提取、化學(xué)成分分析、抗癌抗氧化等方面做了許多的研究,然而絕大部分研究均注重于石榴籽中的脂肪酸及生育酚等,對石榴籽中的多酚類物質(zhì)研究甚少,尤其石榴籽多酚類物質(zhì)的體外抗氧化的研究還不完善,也未見有石榴籽多酚粗提物和純化物的抗氧化對比數(shù)據(jù)[8-14]。因此,本實驗在前人研究基礎(chǔ)上提取并純化石榴籽中的多酚類物質(zhì),分析其對ABTS、羥基、超氧陰離子和DPPH自由基的清除能力,以此評價石榴籽多酚提取物的抗氧化活性,進(jìn)而為拓展石榴籽開發(fā)用途提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

石榴籽由西安丹若爾石榴酒業(yè)有限責(zé)任公司提供;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品天津一方科技有限公司生產(chǎn);Folin-Ciocalteus試劑、無水乙醇、石油醚、氯仿、氫氧化鈉、乙酸乙酯、HCl、碳酸鈉、維生素C、過硫酸鉀、ABTS、焦性沒食子酸、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、DPPH均為國產(chǎn)分析純。

DFY-300型高速萬能粉碎機(jī)溫嶺市林大機(jī)械有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;WFJ-2000型可見光分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司;ME204/02型電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HHW-21CU-600型電熱恒溫水浴鍋上海福瑪實驗設(shè)備有限公司;KQ320OB型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1石榴籽粉的制備選取無雜質(zhì)無霉變的石榴籽置于陽光下曬干,用高速粉碎機(jī)以1000 r/min轉(zhuǎn)速粉碎,索氏提取法脫脂,溶劑為石油醚,以1∶10 g/mL料液比在50 ℃溫度下回流浸提6 h,置于鼓風(fēng)干燥箱,在60 ℃溫度下干燥1 h,得脫脂后的樣品粉末。

1.2.2石榴籽多酚類物質(zhì)的提取及純化參考文獻(xiàn)[10]的方法,稱取5 g脫脂后的石榴籽粉末,加入40%乙醇100 mL,把樣品放入超聲波清洗器中,超聲功率120 W,超聲頻率40 kHz,溫度60 ℃,處理1.5 h,抽濾樣品,取濾液,旋蒸回收有機(jī)溶劑后得多酚粗提物。

多酚的純化采用有機(jī)溶劑萃取法[15],取多酚粗提物,用石油醚萃取,體積比為1∶1,收集水相。石油醚萃取后水相再用氯仿萃取,體積比為1∶1,萃取3次,收集水相。氯仿萃取后水相先用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5,用乙酸乙酯萃取,體積比為1∶1,收集乙酸乙酯相,萃取三次;水相再用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0,再用乙酸乙酯萃取,體積比為1∶1,收集乙酸乙酯相,萃取三次,合并萃取液,40 ℃旋蒸回收有機(jī)溶劑,得到多酚純化物。

1.2.3石榴籽提取物多酚含量的測定

1.2.3.1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制采用Folin-Ciocalteus法(FC法)[16]。稱取沒食子酸10 mg,用蒸餾水溶解并定容于10 mL容量瓶中,得濃度為1 mg/mL的沒食子酸母液。分別移取100、200、300、400、500、600 μL的沒食子酸母液于試管中,用蒸餾水補(bǔ)液至1 mL,分別加入5.0 mL FC試劑,混勻靜置3～8 min,加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的Na2CO3溶液,在室溫下避光放置1 h,于765 nm波長下測定各樣品的吸光度A765。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度A765為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2多酚含量測定取1 mL稀釋一定倍數(shù)的多酚樣品液,加入5.0 mL FC試劑,混勻靜置3～8 min,加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的Na2CO3溶液,在室溫下避光放置1 h,于765 nm波長下測定多酚樣品的吸光度A,平行測定三次,取平均值。計算公式如下:

提取物中多酚濃度(μg/mL)=(A-0.00321)×樣品稀釋倍數(shù)/0.01449

式中,A為樣品液吸光值。

1.2.4石榴籽提取物對ABTS自由基清除效果的測定采用文獻(xiàn)[17]方法測定石榴籽多酚粗提物與純化物對ABTS自由基的清除效果。稱取ABTS粉末0.0286 g,用蒸餾水溶解并定容于5 mL容量瓶內(nèi),制成ABTS儲備液;取5 mL ABTS儲備液于比色管中,加入88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液,在37 ℃恒溫水浴環(huán)境中靜置過夜,可得ABTS中間液。在室溫下,將ABTS中間液用蒸餾水稀釋82倍,得到ABTS工作液。分別取0.5 mL不同質(zhì)量濃度的維生素C溶液、不同總酚濃度的多酚粗提物溶液和多酚純化物溶液,加入4.5 mL ABTS工作液,充分混勻后,在734 nm波長處以蒸餾水為參比,測定其吸光度。計算公式如下:

清除率(%)=[1-(A-B)/A0]×100

式中,A:0.5 mL樣品液+4.5 mL ABTS工作液的吸光度;A0:0.5 mL蒸餾水+4.5 mL ABTS工作液的吸光度;B:0.5 mL樣品液+4.5 mL蒸餾水的吸光度。

清除率(%)=[A0-(A-B)]/A0×100

式中,A:1.0 mL樣品液+0.1 mL鄰苯三酚溶液+3.0 mL Tris-HCl溶液的吸光度值;A0:1.0 mL蒸餾水+0.1 mL鄰苯三酚溶液+3.0 mL Tris-HCl溶液的吸光度值;B:1.0 mL樣品液+3.1 mL蒸餾水的吸光度值。

1.2.6石榴籽提取物對羥基自由基清除效果的測定采用改進(jìn)的Fenton法[19]測定石榴籽多酚粗提物與純化物對·OH的清除效果。移取0.3 mL濃度為20 mmol/L的水楊酸鈉溶液于試管中,加入1.0 mL濃度為1.5 mmol/L FeSO4溶液和0.7 mL濃度為6 mmol/L的H2O2溶液,分別加入不同質(zhì)量濃度的維生素C溶液、不同總酚濃度的多酚粗提物溶液和多酚純化物溶液各1.0 mL,迅速混勻后,37 ℃恒溫水浴1 h,以蒸餾水作空白對照,在510 nm波長處測定吸光度A510。計算公式如下:

清除率(%)=[A0-(A-B)]/A0×100

式中,A:1.0 mL樣品液+0.3 mL水楊酸鈉溶液+1.0 mL FeSO4+0.7 mL H2O2溶液樣液的吸光度;A0:1.0 mL蒸餾水+0.3 mL水楊酸鈉溶液+1.0 mL FeSO4+0.7 mL H2O2溶液樣液的吸光度;B:1.0 mL樣品液+2.0 mL蒸餾水的吸光度。

1.2.7石榴籽提取物對DPPH自由基清除效果的測定采用文獻(xiàn)方法[20]測定石榴籽多酚粗提物與純化物對對DPPH自由基的清除效果。在2.0 mL,60 μmol/L DPPH·的乙醇溶液中分別加入3 mL不同質(zhì)量濃度的維生素C溶液、不同總酚濃度的多酚粗提液和多酚純化液,混勻后在室溫下放置30 min,立即在517 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)517。計算公式如下:

清除率(%)=[A0-(A-B)]/A0×100

式中,A:3.0 mL樣品+2.0 mL DPPH·溶液的吸光值;A0:3.0 mL蒸餾水+2.0 mL DPPH·溶液的吸光值;B:3.0 mL樣品+2.0 mL無水乙醇的吸光值。

1.3　數(shù)據(jù)分析

對標(biāo)準(zhǔn)品吸光度數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析,得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,用Excel繪制擬合曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1　沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。所得曲線的線性度較好,沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.01449x-0.00321,R2值為0.998,式中:y為765 nm波長吸光度,x為沒食子酸質(zhì)量濃度,μg/mL。

圖1　沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of gallic acid

2.2　石榴籽粗提物與純化物多酚含量的測定

按照1.2.2所述方法,采用乙醇提取,液液萃取進(jìn)行純化。根據(jù)圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算粗提液和純化液中的多酚類物質(zhì)濃度,石榴籽多酚粗提液中多酚濃度為0.16 g/L,純化液中多酚類物質(zhì)濃度為0.21 g/L。根據(jù)實驗所需,對提取液進(jìn)行減壓濃縮,除去有機(jī)溶劑,使其總酚濃度達(dá)到實驗要求。

2.3　石榴籽多酚對ABTS陽離子自由基清除效果

如圖2所示的實驗結(jié)果表明,石榴籽中的多酚類物質(zhì)對ABTS陽離子自由基有良好的清除效果。對比多酚粗提物,多酚純化物在一定程度上具有更強(qiáng)的清除自由基能力,在濃度為40 μg/mL時,多酚粗提物對ABTS陽離子自由基清除率為64.33%,相同濃度的純化物對自由基清除率為74.33%,相同濃度及條件下維生素C清除自由基的能力僅為31.46%。對于多酚純化物,其濃度為80 μg/mL時,對自由基的清除率最高。在樣品濃度為100 μg/mL時,多酚粗提物和純化物的清除率都超過了90%,而維生素C對ABTS+·的清除率為62.53%。從IC50值來看,維生素C和石榴籽多酚粗提物、純化物清除ABTS+·的IC50值分別為84.60、37.13和29.11 μg/mL,可見石榴籽多酚提取物比VC有更強(qiáng)的ABTS陽離子自由基清除能力。

圖2　石榴籽多酚提取物對ABTS陽離子自由基的清除能力Fig.2　Scavenging effects of pomegranate seed polyphenols on ABTS radical cation

2.4　石榴籽多酚對超氧陰離子清除效果

圖3　石榴籽多酚提取物對超氧陰離子的清除能力Fig.3　Scavenging effects of pomegranate seed polyphenols on superoxide anion radical

2.5　石榴籽多酚對羥基自由基清除效果

如圖4所示,在所測定的樣品濃度范圍內(nèi),石榴粗提物、石榴純化物和維生素C對·OH的清除率均隨其濃度的增加而增加。石榴籽中的多酚提取物具有明顯的清除羥基自由基的能力,但提取物對·OH的清除效果弱于相同濃度的維生素C,在樣品濃度為100 μg/mL時,維生素C對自由基的清除率就高達(dá)63.35%,而100 μg/mL純化物的清除率僅為23.82%。石榴籽多酚粗提物和純化物清除·OH的IC50值分別為474.37和404.05 μg/mL,由此可見,純化后的多酚提取物清除·OH的能力有所提高。

圖4　石榴籽多酚提取物對羥基自由基的清除能力Fig.4　Scavenging effects of pomegranate seed polyphenols on hydroxyl radical

2.6　石榴籽多酚對DPPH自由基的清除效果

如圖5所示,在被測濃度范圍內(nèi),多酚粗提物、多酚純化物和維生素C對自由基的清除率均隨著濃度的增加而增加。在質(zhì)量濃度范圍內(nèi),在多酚純化物濃度為280 μg/mL時,自由基的清除率達(dá)到85%。使用SPSS計算不同樣品清除DPPH·的IC50值,結(jié)果表明,多酚提取物的IC50為191.82 μg/mL,維生素C和多酚純化物清除DPPH自由基的IC50值分別為133.37和143.26 μg/mL,因此它們清除自由基的能力相似。純化步驟提高了提取物的清除能力。由此可見,石榴籽中的多酚具有較強(qiáng)清除 DPPH自由基的能力,純化步驟顯著提高了DPPH自由基的清除率。

圖5　石榴籽多酚提取物對DPPH自由基的清除能力Fig.5　Scavenging effects of pomegranate seed polyphenols on DPPH radical

3　結(jié)論

石榴籽多酚提取物對不同自由基均有明顯的清除作用,純化工藝能提高多酚提取物清除自由基能力。對于ABTS自由基,石榴籽多酚提取物的清除活性高于維生素C,粗提物和純化物的IC50值分別為37.13和29.11 μg/mL,純化步驟提高了其清除活性。對于超氧陰離子,石榴籽多酚提取物也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的清除能力,其清除活性高于維生素C,粗提物和純化物的IC50值分別為425.21和428.61 μg/mL,純化步驟并未明顯提高其清除活性。多酚粗提物和純化物清除羥基自由基和DPPH自由基能力弱于維生素C,但純化步驟增強(qiáng)了其清除能力。

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