谷氨酸預(yù)處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞上EAAT2表達(dá)的影響

劉書琴

摘要：目的：觀察不同濃度的谷氨酸預(yù)處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞膜上興奮性氨基酸受體（EAAT2）表達(dá)的影響。方法：在純培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上，用低濃度的谷氨酸溶液進(jìn)行連續(xù)短時(shí)刺激，用Western Blot法檢測該細(xì)胞EAAT2的表達(dá)量，以觀察谷氨酸預(yù)處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。結(jié)果：谷氨酸預(yù)處理能夠增加EAAT2的蛋白表達(dá)量，在10μmol/L濃度的谷氨酸預(yù)處理細(xì)胞2h復(fù)灌6h最顯著。結(jié)論：較低濃度的谷氨酸作用較長時(shí)間可以增加EAAT2的表達(dá)量。

關(guān)鍵詞：谷氨酸預(yù)處理；星形膠質(zhì)細(xì)胞；EAAT2

發(fā)生腦缺血時(shí)腦部損傷部位會(huì)產(chǎn)生大量的谷氨酸，谷氨酸的積聚會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生興奮性毒性，研究表明這是導(dǎo)致神經(jīng)元產(chǎn)生繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵。在生理?xiàng)l件下，谷氨酸會(huì)被興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（EAAT）清除，EAAT的一種主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的亞型EAAT2清除谷氨酸作用尤其明顯。有研究報(bào)道，腦缺血損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2表達(dá)會(huì)明顯增加[1]，在星形膠質(zhì)細(xì)胞上過表達(dá)EAAT2，可保護(hù)中等程度的腦缺血損傷[2]。所以，通過增強(qiáng)EAAT2的表達(dá)可保護(hù)神經(jīng)元。但如何才能實(shí)現(xiàn)臨床可應(yīng)用的EAAT2表達(dá)增強(qiáng)呢？有報(bào)道說明一定量的谷氨酸會(huì)誘導(dǎo)EAAT2的表達(dá)，本研究試圖探討通過谷氨酸的預(yù)處理能否改變星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生保護(hù)作用。

一、材料和方法

1、實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器 谷氨酸（Glu）、頭孢曲松鈉（CEF）、丙烯酰胺、甲又雙丙烯酰胺均購自Sigma公司，RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所，一抗兔抗大鼠EAAT2多克隆抗體、一抗兔抗大鼠GFAP多克隆抗體、二抗鼠抗兔抗體均購自武漢博士德生物有限公司。

2、星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 取出生24h內(nèi)的Sprague-Dawley大鼠新生鼠，75%乙醇消毒，斷頭取腦并在解剖顯微鏡下分離出大腦皮層組織，至于0.25%的胰酶中消化18min（37℃）。用5%FBS終止消化后，DMEM清洗，機(jī)械吹打分離細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液離心沉淀，最后將細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，種植于培養(yǎng)瓶內(nèi)。3-5天換液，9-10天后于恒溫?fù)u床260rpm搖12小時(shí)以去除神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等，棄除細(xì)胞懸液后0.25%的胰酶中消化1-3min（37℃），5%FBS終止消化后吹打懸浮細(xì)胞，離心沉淀后再重懸細(xì)胞于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中。

3、蛋白質(zhì)樣品制備 取出RIPA裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的終濃度為1mM待用。將處理后的細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，用PBS洗兩遍，之后加入溶解了PMSF的裂解液，每孔200ul，放在冰上震蕩15min。用刮板刀輕輕刮每個(gè)孔底部，能看到淡淡白色物質(zhì)，將每孔內(nèi)的物質(zhì)分別吸到每個(gè)EP管內(nèi)，輕輕吹打數(shù)次后4℃12000g離心30min。將每孔上清分別吸至新EP管，-20℃保存。

4、蛋白印跡法（western blot） 蛋白定量配平各組蛋白濃度后，加入SDS Loading Buffer95℃變性5min，樣品蛋白（20μg）行10%SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。5﹪羊血清封閉硝酸纖維素膜2 h后，加入EAAT2抗體（1：400）、GFAP抗體（1：2000）或β-actin一抗（1：2000），4℃反應(yīng)過夜。次日洗膜，加入1：1000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h，洗膜后加ECL顯色劑，X片顯影。Image J圖象分析軟件根據(jù)光密度定量分析。

二、觀察指標(biāo)

每組設(shè)置空白組，絕對(duì)興奮組及實(shí)驗(yàn)組，絕對(duì)興奮組選用CEF（頭孢曲松鈉）作為絕對(duì)興奮劑，取兩種不同濃度。星形膠質(zhì)細(xì)胞在六孔細(xì)胞板上進(jìn)行預(yù)處理，每組實(shí)驗(yàn)擬定兩塊細(xì)胞板。

1、每塊細(xì)胞板控制預(yù)處理的Glutamate溶液和CEF溶液的溶度相同，預(yù)處理30 min，處理結(jié)束后換上新鮮培養(yǎng)液，復(fù)灌6 h。

2、每塊細(xì)胞板控制預(yù)處理的Glutamate溶液和CEF溶液的溶度相同，預(yù)處理2 h，處理結(jié)束后換上新鮮培養(yǎng)液，復(fù)灌6h。

3、細(xì)胞板控制預(yù)處理的Glutamate溶液和CEF溶液的時(shí)間為2 h，每組下采用Glutamate濃度梯度處理細(xì)胞。

4、細(xì)胞板控制預(yù)處理的Glutamate溶液和CEF溶液的時(shí)間為48 h，每組下采用Glutamate濃度梯度處理細(xì)胞。

5、以上處理結(jié)束后，均用western-blotting方法對(duì)蛋白進(jìn)行分離和定量分析。

6、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均由Microsoft office2010處理，進(jìn)行假設(shè)t檢驗(yàn)；圖均用Graphpad Prism5繪制。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1不同濃度的Glutamate預(yù)處理30min復(fù)灌6h對(duì)EAAT2表達(dá)的影響

如圖1所示，各濃度Glutamate處理30min都不能明顯增加EAAT2的表達(dá)量，陽性對(duì)照CEF組能明顯增加EAAT2的表達(dá)量。

30min/6h谷氨酸處理后EAAT2表達(dá)的Western blot灰度分析結(jié)果。Image J圖象分析軟件根據(jù)光密度定量分析。數(shù)值均以control組值作為對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并以mean ± SEM （n≥4）的形式給出。*P<0.05與Control組相比。

3.2不同濃度的Glutamate預(yù)處理2h復(fù)灌6h對(duì)EAAT2表達(dá)的影響

如圖2所示，10uM Glutamate處理2h可以明顯增加EAAT2的表達(dá)量，陽性對(duì)照CEF組能明顯增加EAAT2的表達(dá)量。

2h/6h谷氨酸處理后EAAT2表達(dá)的Western blot灰度分析結(jié)果。Image J圖象分析軟件根據(jù)光密度定量分析。數(shù)值均以control組值作為對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并以mean ± SEM （n≥4）的形式給出。*P<0.05，**P<0.01與Control組相比。

四、討論

腦缺血損傷時(shí)，谷氨酸因過度釋放會(huì)大量積聚在損傷部位的神經(jīng)細(xì)胞突觸間隙中，這將會(huì)過度激活細(xì)胞膜上的受體，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性，是神經(jīng)細(xì)胞功能損傷的重要病理生理基礎(chǔ)[3]。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體可以攝取損傷產(chǎn)生的大量谷氨酸，研究表明多種生理和病理生理的刺激能調(diào)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和表達(dá)：低濃度Glu作用6h，大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞即有凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)，12h后漸增多，以18h達(dá)到高峰，為12%[4]。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)是基礎(chǔ)與臨床神經(jīng)科學(xué)研究的基礎(chǔ)，研究星形膠質(zhì)細(xì)胞Glutamate等化學(xué)因素?fù)p傷后的細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)的改變，對(duì)于研究疾病機(jī)理、指導(dǎo)臨床診斷治療具有一定的意義。

本研究中，各濃度組谷氨酸處理30min復(fù)灌6h后，10uM濃度組能稍微增加EAAT2的表達(dá)，但并沒有顯著性差異，所以，我們得出結(jié)論：各濃度谷氨酸處理30min都不能明顯增加EAAT2的表達(dá)量，陽性對(duì)照CEF組能明顯增加EAAT2的表達(dá)量。各濃度組谷氨酸處理2h復(fù)灌6h后，能夠明顯增加EAAT2的表達(dá)量，并且在10uM濃度組最為明顯（P<0.01），甚至和陽性對(duì)照組相當(dāng)，所以，我們得出結(jié)論：10uM 谷氨酸處理2h復(fù)灌6h能明顯增加EAAT2的表達(dá)量。最終結(jié)論為：谷氨酸預(yù)處理能夠增加EAAT2的蛋白表達(dá)量，在10μmol/L濃度的谷氨酸預(yù)處理2h最顯著。即較低濃度的谷氨酸作用較長時(shí)間可以增加EAAT2的表達(dá)量。

參考文獻(xiàn)：

[1]粱輝，陳虎，蔡定芳.急性腦缺血損傷大鼠海馬神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)[J].中國病理生理雜志，2005，21（6）： 1061-1065.

[2]張光運(yùn)，段麗，饒志仁.局灶性腦梗死引起谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)[J].解剖學(xué)報(bào)，2004，35（6）：574-577.

[3]Lo EH，Moskowitz MA，Jacobs TP.Exciting radical suicidal： how brain cells die a Rerstroke[J].Stroke， 2005，36（2）： 189-192.

[4]楊翠，趙晏.谷氨酸介導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡[J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22（3）：75-77.

基金項(xiàng)目：作者主持皖南醫(yī)學(xué)院2017年度中青年科研基金項(xiàng)目“谷氨酸預(yù)處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2表達(dá)和氧糖剝奪神經(jīng)元存活率的影響”（編號(hào)：WK201701）