PPARγPck1mTOR信號通路在高尿酸血癥誘導胰島細胞凋亡中的作用

[摘要]目的

了解過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pck1）雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路在高尿酸血癥導致胰島細胞凋亡中的作用。

方法用普通飲食喂養(yǎng)雄性敲除尿酸氧化酶自發(fā)高尿酸血癥小鼠（SCDKO，n=7）及對照野生型小鼠（SCDWT，n=7），18周時進行葡萄糖耐量試驗（GTT），20周時行胰島素耐量試驗（ITT），并檢測血清中的尿酸（UA）和空腹胰島素（FINS）水平，TUNEL染色檢測各組胰島細胞凋亡情況，蘇木精伊紅（HE）染色觀察胰腺細胞的結(jié)構(gòu)及形態(tài)，Western blot和RTPCR方法檢測各組胰腺組織中PPARγ、Pck1、mTOR蛋白和mRNA表達水平。

結(jié)果實驗前后SCDKO組小鼠的UA水平顯著高于SCDWT組（t=20.67、22.60，Plt;0.01）;SCDWT組與SCDKO組空腹血糖（FBG）、FINS實驗前后差異無顯著性（Pgt;0.05）。GTT結(jié)果顯示，SCDKO組15、30 min時血糖水平較SCDWT組顯著升高（t=2.20、2.30，Plt;0.05），15 min時SCDKO組胰島素水平較SCDWT組低（t=6.70，Plt;0.05）。GTT結(jié)果顯示，兩組FINS敏感性差異無顯著性（Pgt;0.05）。HE染色顯示，SCDKO組胰腺細胞的損害程度較SCDWT組重。與SCDWT組比較，SCDKO組細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.30，Plt;0.05）。SCDKO組PPARγ、Pck1、mTOR mRNA和蛋白的相對表達量均較SCDWT組升高（t=2.85～6.61，Plt;0.05）。

結(jié)論PPARγPck1mTOR信號通路可能參與了高尿酸血癥導致胰島細胞凋亡的過程。

[關(guān)鍵詞]高尿酸血癥;過氧化物酶體增殖物激活受體γ;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶;雷帕霉素靶蛋白;胰島素分泌細胞;細胞凋亡

[中圖分類號]R589.7

[文獻標志碼]A

[文章編號] 20965532（2018）02013905

多項前瞻性研究證實，血尿酸（UA）水平與2型糖尿病的患病風險密切相關(guān)[12]。薈萃分析發(fā)現(xiàn)，普通人群中血UA水平每增加60 μmol/L，新發(fā)糖尿病的風險增加17%[3]。胰島素抵抗和胰島β細胞功能缺陷是2型糖尿病的主要病因，其中胰島β細胞凋亡是2型糖尿病的重要促進因素。持續(xù)性高尿酸血癥引起的胰島β細胞凋亡和功能異常是導致血糖水平升高的重要原因。動物實驗發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射UA后小鼠糖耐量異常，葡萄糖刺激胰島素分泌減少，胰島縮小，胰島β細胞數(shù)量減少。課題組前期研究結(jié)果顯示，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pck1）可能是高尿酸血癥誘導胰島β細胞凋亡的高度關(guān)聯(lián)蛋白[4]。而Pck1的表達可被過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）誘導，PPARγ還能夠調(diào)控脂質(zhì)代謝和糖代謝[5]。而Pck1過表達可以引起細胞內(nèi)葡萄糖濃度升高，局部高血糖可激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR），后者可以引起細胞凋亡。因此，推測UA可能通過誘導氧化應激反應，激活PPARγPCK1mTOR信號通路，促進胰島β細胞凋亡。本實驗研究PPARγPck1mTOR信號通路在高尿酸血癥導致胰島細胞凋亡中的作用，旨在為臨床治療高尿酸血癥合并糖尿病病人提供一種新的方法。

1材料和方法

1.1實驗材料

UA測定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，北京）;胰島素試劑盒（ALPCO公司，美國）;快速血糖儀（東芝公司，日本）;兔抗鼠PPARγ多克隆一抗、兔抗鼠Pck1多克隆一抗以及兔抗鼠mTOR多克隆一抗（伊萊瑞特生物科技股份有限公司，武漢）;兔抗鼠βactin內(nèi)參（Proteintech，美國）;BCA定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）;熒光RTPCR試劑盒（SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，Takara）;蘇木精伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2實驗分組與處理

選取8周齡雄性敲除UA氧化酶自發(fā)高尿酸血癥小鼠（KO）及對照野生型小鼠（WT）小鼠各7只，均普通飼料喂養(yǎng)，分別作為SCDKO組和SCDWT組。將小鼠飼養(yǎng)在無菌通風的籠中，自由飲水、攝食，12 h晝夜循環(huán)，室溫（22±2）℃。

1.3檢測指標及方法

1.3.1小鼠血糖、胰島素及UA檢測小鼠每周禁食不禁水8 h，于次日9：00檢測空腹血糖（FBG），隔周檢測UA和空腹胰島素（FINS）;并于喂養(yǎng)18周時進行葡萄糖耐量試驗（GTT），20周時行胰島素耐量試驗（ITT）。GTT檢測方法：小鼠禁食8 h后腹腔注射D葡萄糖2 g/kg，用快速血糖儀測定0、15、30、60和120 min時的鼠尾血糖。ITT檢測方法：小鼠禁食4 h并腹腔注射胰島素1.0 U/kg，注射后0、15、30、60、120 min時測定鼠尾血糖水平。

1.3.2HE染色檢測胰腺病理改變20周后處死小鼠，收集部分胰島組織，在40 g/L多聚甲醛中固定30 min，-80 ℃冰箱儲存。根據(jù)HE染色試劑盒說明書染色，顯微鏡下觀察胰腺細胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)。

1.3.3TUNEL染色檢測細胞凋亡取小鼠胰腺組織石蠟切片，按TUNEL試劑盒說明書操作。免疫熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。所有切片在高倍視野下（400倍）拍照，每張切片選擇5個胰島共計200～500個細胞，計數(shù)凋亡細胞。

1.3.4RTPCR方法檢測PPARγ、Pck1、mTOR mRNA表達取胰腺組織，采用Trizol方法抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光RTPCR試劑盒進行擴增，擴增條件：95 ℃變性，15 s;58 ℃退火，20 s;68 ℃拉伸，20 s;共擴增40個循環(huán)。用2-ΔΔCt表示目的基因相對定量。PCR引物及其序列見表1。

1.3.5Western blot方法檢測PPARγ、Pck1以及mTOR蛋白表達水平取少量胰腺組織，加入組織3倍體積的蛋白裂解液裂解，取上清液。應用BCA蛋白濃度試劑盒測定PPARγ、Pck1、mTOR蛋白濃度。SDSPAGE電泳，100 ℃水浴鍋煮沸蛋白質(zhì);待蛋白Marker分離完全，進行Western blot操作。轉(zhuǎn)膜并與抗體雜交：加一抗于封閉液中，4 ℃過夜孵育;第2天洗膜;與二抗反應;于Odyssey紅外線熒光掃膜成像儀上計算灰度值。

1.4統(tǒng)計學處理

應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料結(jié)果以[AKx-D]±s形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用LSDt檢驗。以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1兩組小鼠UA、FBG、FINS及GTT結(jié)果比較

基礎(chǔ)時SCDKO組與SCDWT組FBG、FINS差異無顯著性（Pgt;0.05），SCDKO組UA水平高于SCDWT組（t=20.67，Plt;0.01）;實驗20周時（造模后）SCDKO組與SCDWT組FBG、FINS差異無顯著性（Pgt;0.05），SCDKO組UA顯著高于SCDWT組（t=22.60，Plt;0.01）。SCDKO組實驗前后UA、FBG、FINS水平相比較均差異無顯著性（Pgt;0.05）;SCDWT組實驗前后UA、FBG、FINS水平比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。GTT結(jié)果顯示，SCDKO組15、30 min時血糖水平較SCDWT組均顯著升高（t=2.20、2.30，Plt;0.05），15 min時SCDKO組胰島素水平較SCDWT組低[（1.02±0.07）μg/L vs （1.35±0.05）μg/L]，差異有顯著性（t=6.70，Plt;0.05）;ITT結(jié)果顯示，SCDKO組與SCDWT組0、15、30、60和120 min時間點血糖水平差異均無顯著性（Pgt;0.05）。見表2、圖1。

2.2兩組小鼠胰腺組織HE染色結(jié)果比較

SCDWT組胰島細胞呈條索狀排列，細胞間有豐富的毛細血管，細胞結(jié)構(gòu)清晰;SCDKO組小鼠胰島細胞腫脹，輪廓不清，細胞核固縮（圖2A、B）。

2.3兩組小鼠胰島細胞凋亡比較

免疫熒光觀察顯示，凋亡的細胞核呈綠色（圖2C、D）。SCDWT組、SCDKO組的胰島細胞凋亡率分別為（1.93±0.49）%、（6.42±0.62）%，兩組比較差異有顯著性（t=2.30，Plt;0.05）。

2.4兩組小鼠胰腺組織中PPARγ、Pck1、mTOR mRNA相對表達量比較

與SCDWT組比較，SCDKO組小鼠胰腺組織中PPARγ、Pck1、mTOR的mRNA相對表達量均顯著升高（t=2.85～4.39，Plt;0.05）。見圖3、表3。

2.5兩組小鼠胰腺組織中PPARγ、Pck1、mTOR蛋白相對表達量比較

與SCDWT組小鼠比較，SCDKO組PPARγ、Pck1、mTOR蛋白相對表達量均升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.64～6.61，Plt;0.05）。見圖3、表2。

3討論

近年來，高尿酸血癥的患病率越來越高，而血清UA水平升高可使患糖尿病的風險增加[67]。高尿酸血癥在2型糖尿病的發(fā)生及演變過程中起著重要作用。橫斷面和前瞻性研究顯示，高尿酸血癥與葡萄糖代謝紊亂之間有正相關(guān)關(guān)系[89]。具有穩(wěn)定的和長壽命的高尿酸血癥小鼠模型對于高尿酸血癥相關(guān)疾病的研究至關(guān)重要。本研究通過在C57BL/6小鼠的肝臟中敲除UA氧化酶基因構(gòu)建了一種新的高尿酸血癥小鼠模型用于實驗研究。

本文研究結(jié)果顯示，SCDKO組小鼠實驗前后UA水平均顯著高于SCDWT組，保證了實驗的可行性;SCDKO組與SCDWT組實驗前后的FBG、FINS差異均無顯著性;ITT結(jié)果顯示SCDKO組與SCDWT組血糖水平差異無顯著性;但GTT結(jié)果顯示，SCDKO組小鼠在15～30 min時血糖水平明顯升高，15 min時的胰島素水平顯著低于SCDWT組，推測葡萄糖代謝紊亂可能與胰島β細胞分泌的胰島素不足有關(guān)，而非胰島素抵抗導致糖代謝異常。LU等[4]研究顯示，KO小鼠和WT小鼠的ITT實驗結(jié)果差異無顯著性，表明葡萄糖代謝異常不是胰島素抵抗造成的，可能存在其他的潛在機制。有研究顯示，高尿酸血癥可能通過降低胰島素敏感性導致2型糖尿病[1012]。另有研究結(jié)果顯示，高尿酸血癥病人的UA水平對胰島素敏感指數(shù)無明顯影響[13]。在葡萄糖耐量減低的高尿酸血癥人群中，UA可直接損傷胰島β細胞的功能[4]。本實驗胰腺組織HE染色結(jié)果顯示，SCDKO組胰腺細胞出現(xiàn)腫脹，細胞間隙不清晰，形狀不規(guī)則，細胞核固縮;細胞凋亡率明顯升高。推測高尿酸血癥可能加快了胰島β細胞的凋亡。LU等[4]研究顯示，高尿酸血癥可促進腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導的胰島細胞凋亡。臨床研究發(fā)現(xiàn)，確診時糖尿病病人體內(nèi)胰島β細胞數(shù)量已經(jīng)減少50%，而尸檢結(jié)果顯示胰島細胞的減少主要是β細胞凋亡[14]，說明在血糖升高之前已存在大量胰島β細胞凋亡。

本文RTPCR結(jié)果顯示，SCDKO組PPARγ、Pck1、mTOR的mRNA和蛋白表達水平均高于SCDWT組小鼠，提示高尿酸血癥可能通過影響PPARγ、Pck1、mTOR基因的表達，促進其蛋白的表達，最終損傷胰島細胞。還有研究顯示，UA經(jīng)有機陰離子轉(zhuǎn)運體（OAT）進入胰島β細胞，引發(fā)氧化應激，產(chǎn)生大量氧自由基（ROS），而ROS可直接激活PPARγ[15]。PPARγ是一種廣泛表達的核受體，主要存在于脂肪、結(jié)腸和巨噬細胞[16]。PPARγ與類視色素X受體（RXR）結(jié)合構(gòu)成二聚體，通過調(diào)控靶基因表達調(diào)控脂代謝和糖代謝[16]。Pck1催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和CO2，是糖異生過程的限速酶。Pck1主要表達在肝、腎和脂肪，正常生理狀態(tài)下Pck1在成年小鼠胰島中幾乎不表達[17]。Pck1表達可被胰高血糖素、糖皮質(zhì)激素和cAMP誘導，被胰島素抑制[18]。Pck1對維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，Pck1過表達可誘發(fā)2型糖尿病。此外，有研究結(jié)果顯示Pck1的表達可被PPARγ誘導[19]。Pck1過表達可引起細胞內(nèi)葡萄糖濃度升高，局部高糖血癥可激活mTOR，而活

化的mTOR可使胰島素受體底物2（IRS2）絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，引起IRS2泛素化而被降解，最終導致細胞凋亡[19]。本文的研究結(jié)果顯示，SCDKO組PPARγ、Pck1、mTOR的mRNA和蛋白相對表達量均升高，提示UA可能通過影響PPARγPck1mTOR信號通路來誘導胰島β細胞凋亡。有研究表明，高尿酸血癥誘發(fā)氧化應激反應，產(chǎn)生的ROS可通過抑制NO誘導iNOS表達，iNOS過表達可激活PPARγ誘導Pck1表達，激活mTOR，促使IRS2磷酸化，導致細胞凋亡[20]。iNOS表達升高生成大量NO，引起胰島β細胞凋亡。

總之，UA可能參與了PPARγPck1mTOR信號通路誘導胰島細胞凋亡的過程。因此，對于高尿酸血癥病人，要積極監(jiān)測血UA的變化，進行針對性的降UA治療，以降低UA對胰島的損害。本研究為高尿酸血癥合并糖尿病的精準治療提供新的靶點和依據(jù)，為高尿酸血癥的研究開辟了新的思路。但UA對于胰島細胞凋亡作用的機制還未完全清楚，需進一步的深入研究。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）