用稀釋回歸法對(duì)微量血漿標(biāo)本進(jìn)行凝血功能檢測(cè)的效果探討

毛睿哲，邵雪君

（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000）

凝血功能檢測(cè)是臨床上在進(jìn)行止血與血栓篩查時(shí)常用的檢查方法，包括進(jìn)行凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）及纖維蛋白原（FIB）檢測(cè)等[1]。過去，臨床上常用手工法進(jìn)行凝血功能檢測(cè)。該方法具有檢測(cè)過程繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、對(duì)操作人員的要求較高等弊端，已無(wú)法滿足現(xiàn)代臨床的需求。目前，臨床上主要使用全自動(dòng)血凝儀進(jìn)行凝血功能檢測(cè)[2]。該儀器對(duì)受檢的血漿標(biāo)本的容量有一定的要求。然而，在兒科臨床上，新生兒及部分患兒（如患有先天性心臟病）血細(xì)胞的比容（多在0.530%～0.800%之間）通常明顯高于正常兒童[3]，其血漿的容量則小于正常兒童。而且，在用全自動(dòng)血凝儀對(duì)微量血漿標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，探針的運(yùn)動(dòng)精度、零部件的磨損程度等因素均可導(dǎo)致探針無(wú)法吸取足量的血漿標(biāo)本，或僅吸取了血漿下的血細(xì)胞，導(dǎo)致探針的針孔被堵塞，進(jìn)而使儀器發(fā)生故障。因此，如何合理地利用微量的血漿標(biāo)本進(jìn)行凝血功能檢測(cè)成為臨床上研究的重點(diǎn)。有研究人員發(fā)現(xiàn)，在血漿標(biāo)本中加入與全自動(dòng)血凝儀配套的樣本稀釋液等液相物質(zhì)，加大血漿標(biāo)本的容量，可滿足儀器對(duì)血漿標(biāo)本容量的要求。在本次研究中，筆者通過對(duì)蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的43例患兒的血漿標(biāo)本、2倍稀釋度血漿標(biāo)本和3倍稀釋度血漿標(biāo)本進(jìn)行PT、APTT檢測(cè)，探討用稀釋回歸法對(duì)微量血漿標(biāo)本進(jìn)行凝血功能檢測(cè)的臨床效果。

1　標(biāo)本采集與檢測(cè)方法

1.1　標(biāo)本采集

隨機(jī)選取某日在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院門診、心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、新生兒科、血液科及外科等就診的43例患兒作為研究對(duì)象，分別采集其2ml的血漿標(biāo)本。在采集血漿標(biāo)本后的1 h內(nèi)進(jìn)行本次試驗(yàn)。對(duì)于血細(xì)胞比容在0.250～0.550之間的患兒，使用以濃度為3.2%的枸櫞酸鈉溶液（109 mmol/L）為抗凝劑的真空抗凝管，按1：9（抗凝劑與血漿的比例）的比例采集其1.8ml的全血，將二者充分混勻后，以4000 r/min的速度進(jìn)行10min的離心處理，然后得到2ml的血漿標(biāo)本。對(duì)于血細(xì)胞比容＜0.250、＞0.550的患兒，依據(jù)Macgann推薦公式計(jì)算其抗凝劑的使用量。該公式為：抗凝劑用量（ml）=0.00185×全血量（ml）×[100-患者的血細(xì)胞比容（%）][4]。在使用上述的公式計(jì)算出抗凝劑的使用量后，將相應(yīng)量的枸櫞酸鈉溶液（109 mmol/L）加入到惰性塑料采血管內(nèi)。用一次性塑料注射器抽取患兒1.8ml的血漿，將其立即注入到惰性塑料采血管內(nèi)，蓋緊瓶蓋，使其與抗凝劑充分混勻，然后以4000 r/min的速度進(jìn)行10min的離心處理，得到血漿標(biāo)本。

1.2　儀器與試劑

使用法國(guó)STAGO STA-R全自動(dòng)血凝儀及其配套的試劑與定值質(zhì)控血漿進(jìn)行本次試驗(yàn)。PT試劑與APTT試劑的批號(hào)分別為250498、250596。使用與全自動(dòng)血凝儀配套的Owern-Koller稀釋液進(jìn)行血漿標(biāo)本稀釋。正常（N值）定值質(zhì)控血漿和病理（P值）定值質(zhì)控血漿的批號(hào)分別為12351、12352。在此前進(jìn)行的預(yù)試驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)，對(duì)血漿標(biāo)本進(jìn)行4倍的稀釋后，其APTT值常高于180 s，超出了全自動(dòng)血凝儀的檢測(cè)范圍。因此，本次試驗(yàn)選擇2倍稀釋度血漿標(biāo)本和3倍稀釋度血漿標(biāo)本作為研究的對(duì)象。已有的研究報(bào)道指出，使用STAGO STA-R全自動(dòng)血凝儀進(jìn)行FIB檢測(cè)能呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)度[5-6]，故本文也不再對(duì)其進(jìn)行贅述。

1.3　方法

從這43例患兒的血漿標(biāo)本中分別吸取1ml的血漿，作為原血漿標(biāo)本。從這43例患兒的血漿標(biāo)本中分別吸取0.5ml的血漿，將其與0.5ml 的Owern-Koller稀釋液充分混勻，將該混合液作為2倍稀釋度血漿標(biāo)本。從這43例患兒的血漿標(biāo)本中分別吸取0.5ml的血漿，將其與1ml的Owern-Koller稀釋液充分混勻，將該混合液作為3倍稀釋度血漿標(biāo)本。使用STAGO STA-R全自動(dòng)血凝儀對(duì)上述的三種血漿標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，分別得出每種血漿標(biāo)本的PT值、APTT值。原血漿標(biāo)本的PT值、APTT值若與2倍稀釋度血漿標(biāo)本、3倍稀釋度血漿標(biāo)本的PT值、APTT值呈線性相關(guān)，則可得到相應(yīng)的線性回歸方程。將2倍稀釋度血漿標(biāo)本、3倍稀釋度血漿標(biāo)本的PT值、APTT值分別代入回歸方程中，然后將得到的結(jié)果與原血漿標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，觀察這三種血漿標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本次研究中原始數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，最終結(jié)果采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　對(duì)原血漿標(biāo)本、2倍稀釋度血漿標(biāo)本及3倍稀釋度血漿標(biāo)本進(jìn)行PT、APTT檢測(cè)的結(jié)果

將原血漿標(biāo)本的PT值作為橫坐標(biāo)，將2倍稀釋度血漿標(biāo)本與3倍稀釋度血漿標(biāo)本的PT值作為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖。結(jié)果顯示，兩種不同稀釋度的血漿標(biāo)本其PT值與原血漿標(biāo)本的PT值呈線性相關(guān)性。用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)該散點(diǎn)圖進(jìn)行分析后，得到相應(yīng)的回歸方程。其中，2倍稀釋度血漿標(biāo)本的PT值若為x，原血漿標(biāo)本的PT值若為y，則回歸方程為：y=0.835x-1.567（r=0.884，P=0.00）；3倍稀釋度血漿標(biāo)本的PT值若為x，原血漿標(biāo)本的PT值若為y，則回歸方程為：y=0.353x+5.815（r=0.535，P=0.00）。詳見圖1、圖2。

圖1　原血漿標(biāo)本與2倍稀釋度血漿標(biāo)本PT值散點(diǎn)圖的對(duì)比

圖2　原血漿標(biāo)本與3倍稀釋度血漿標(biāo)本PT值散點(diǎn)圖的對(duì)比

將原血漿標(biāo)本的APTT值作為橫坐標(biāo)，將2倍稀釋度血漿標(biāo)本和3倍稀釋度血漿標(biāo)本的APTT值作為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖。結(jié)果顯示，兩種不同稀釋度血漿標(biāo)本的APTT值與原血漿標(biāo)本的APTT值呈線性相關(guān)。其中，2倍稀釋度血漿標(biāo)本的APPT值若為x，原血漿標(biāo)本的APPT值若為y，則回歸方程為：y=0.538x+4.215（r=0.785，P=0.00）；3倍稀釋度血漿標(biāo)本的APTT值若為x，原血漿標(biāo)本的APTT值若為y，則回歸方程為：y=0.220x+17.816。（r=0.720，P=0.00）。詳見圖3、圖 4。

圖3　原血漿標(biāo)本與2倍稀釋度血漿標(biāo)本APPT值散點(diǎn)圖的對(duì)比

圖4　原血漿標(biāo)本與3倍稀釋度血漿標(biāo)本APTT值散點(diǎn)圖的對(duì)比

2.2　對(duì)原血漿標(biāo)本、2倍稀釋度血漿標(biāo)本及3倍稀釋度血漿標(biāo)本進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果

將2倍稀釋度血漿標(biāo)本及3倍稀釋度血漿標(biāo)本的PT值、APTT值分別代入相應(yīng)的回歸方程中進(jìn)行換算，并將換算結(jié)果與原血漿標(biāo)本的PT值、APTT值進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，三種血漿標(biāo)本的PT值、APTT值相比，P＞0.05。詳見表1、表2。

表1　對(duì)原血漿標(biāo)本與2倍稀釋度血漿標(biāo)本進(jìn)行PT、APTT檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比 （ ±s ）

表1　對(duì)原血漿標(biāo)本與2倍稀釋度血漿標(biāo)本進(jìn)行PT、APTT檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比 （ ±s ）

項(xiàng)目　原血漿標(biāo)本　2倍稀釋度血漿標(biāo)本　t值　P值PT（s）　14.37±1.41　14.37±1.01　0.978　＞0.05 APTT（s） 41.55±5.58　41.52±4.37　0.958

表2　對(duì)原血漿標(biāo)本與3倍稀釋度血漿標(biāo)本進(jìn)行PT、APTT檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比 （ ±s ）

表2　對(duì)原血漿標(biāo)本與3倍稀釋度血漿標(biāo)本進(jìn)行PT、APTT檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比 （ ±s ）

項(xiàng)目　原血漿標(biāo)本　3倍稀釋度血漿標(biāo)本　t值　P值PT（s）　14.37±1.41　14.37±0.60　0.975?。?.05 APTT（s）　41.55±5.58　41.51±3.96　0.950

3　討論

臨床上在進(jìn)行凝血功能檢測(cè)時(shí)，對(duì)血漿標(biāo)本與抗凝劑的比例有嚴(yán)格的要求。然而，兒童患者及其家屬往往對(duì)重復(fù)進(jìn)行血漿標(biāo)本的采集存在抵觸的心理，大大地增加了兒科采集合格的血漿標(biāo)本的難度。比如使用容量為1.8ml的真空抗凝管采集1份血細(xì)胞比容在0.550左右的血漿標(biāo)本，在進(jìn)行離心處理后得到的血漿標(biāo)本的含量?jī)H在0.81ml左右。血細(xì)胞的比容若再增加，則血漿標(biāo)本的含量將進(jìn)一步減少。以STAGO STA-R全自動(dòng)血凝儀為例。該血凝儀的使用說(shuō)明要求，在用其進(jìn)行PT、APTT及FIB檢測(cè)時(shí)，血漿標(biāo)本的容量須＞0.25ml。而在實(shí)際的操作過程中，受儀器探針的運(yùn)動(dòng)精度和零部件損耗等因素的影響，所需血漿標(biāo)本的實(shí)際容量必須在0.50ml以上。只有這樣，才能確保該儀器的探針能吸入足量的血漿標(biāo)本，并對(duì)每個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行正確的檢測(cè)。

在本次研究中，筆者結(jié)合前人的研究經(jīng)驗(yàn)[7-8]和自身的臨床實(shí)踐，對(duì)待檢測(cè)的血漿標(biāo)本分別進(jìn)行了2倍預(yù)稀釋和3倍預(yù)稀釋，然后采用稀釋回歸法測(cè)定預(yù)稀釋后血漿標(biāo)本的PT值和APTT值，以解決由血漿樣本容量較少所帶來(lái)的無(wú)法進(jìn)行有效檢測(cè)的問題。本次研究的結(jié)果表明，2倍稀釋度血漿標(biāo)本和3倍稀釋度血漿標(biāo)本的PT值、APTT值與原血漿標(biāo)本的PT值、APTT值相比，P＞0.05。這說(shuō)明，用稀釋回歸法對(duì)微量血漿標(biāo)本進(jìn)行PT、APTT檢測(cè)的可行性良好，其檢測(cè)結(jié)果可滿足一般臨床檢查的需求。各實(shí)驗(yàn)室可依據(jù)自身儀器的性能、試劑批號(hào)等情況，制定合適的回歸方程來(lái)解決類似的問題。

需要注意的是，由于參與本次研究的患兒均不存在彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），也未患有其他的凝血障礙性疾病，故是否可用該檢查方法對(duì)血漿標(biāo)本量偏少、患有DIC或其他凝血障礙性疾病的患兒進(jìn)行PT、APTT檢測(cè)，仍需臨床上進(jìn)行進(jìn)一步的研究[9]。

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