不同結(jié)晶結(jié)構(gòu)淀粉的拉曼光譜分析

史苗苗，李丹，閆溢哲，劉延奇

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州，450002)

淀粉主要由直鏈淀粉和高度支化的支鏈淀粉構(gòu)成，線性直鏈淀粉的結(jié)構(gòu)通過(guò)α-(1→4)糖苷鍵形成，支鏈淀粉分子結(jié)構(gòu)由α-(1→4)糖苷鍵形成主鍵，α-(1→6)糖苷鍵形成分支[1-2]。根據(jù)X-射線衍射圖譜，可將淀粉分為A型，B型，C型和V型。A型在15°、17°、18°、23°等處呈現(xiàn)明顯的衍射峰；B型在5.6°、17°、24°處有明顯的衍射峰；C型有天然的C型和由A型或B型轉(zhuǎn)化而得到，衍射峰包括了A型與B型的峰型；V型是直鏈淀粉和脂肪酸、乳化劑、醇類和碘等配體形成的復(fù)合物，在7.8°、12.5°和19.5°處有衍射峰，它是以單螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成的，一般與其他晶型共生存在[3]。

拉曼光譜是一種散射光譜，通過(guò)拉曼散射峰的強(qiáng)度、位置來(lái)反映分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)，分析化合物分子中不同的官能團(tuán)或化學(xué)鍵，以此獲取化學(xué)物中分子結(jié)構(gòu)的信息[4]。

淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的不同是由于分子的排列方式和晶體取向不同[5]，對(duì)淀粉進(jìn)行不同處理時(shí)，分子排列發(fā)生改變，晶體結(jié)構(gòu)會(huì)改變，拉曼光譜也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)變化，因此，拉曼光譜可以應(yīng)用于淀粉晶體結(jié)構(gòu)的研究[6-8]，SCHUSTER[9]等用α-淀粉酶和淀粉糖苷酶水解淀粉，研究糊化和水解過(guò)程中淀粉的拉曼譜圖特征；LIU[10]等研究了拉曼光譜在玉米淀粉結(jié)構(gòu)及其結(jié)晶度計(jì)算中的應(yīng)用；PICCININI[11]等使用近紅外傅里葉變換拉曼光譜來(lái)檢測(cè)面包屑的淀粉回生。目前，通過(guò)拉曼光譜對(duì)淀粉結(jié)構(gòu)有了一定的了解，所以，可以利用其檢測(cè)原理對(duì)食品原料的某些特性進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

本文以馬鈴薯淀粉為原料,通過(guò)酸解、重結(jié)晶等步驟制備酸解淀粉、B型微晶淀粉及V型淀粉-正癸醇/十二醇復(fù)合物，并運(yùn)用PeakFit v4.12軟件對(duì)其拉曼光譜譜圖進(jìn)行分析研究，為淀粉的改性提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

馬鈴薯淀粉(食品級(jí))，河南恒祥進(jìn)出口有限公司；正癸醇(分析級(jí))，阿拉丁生化科技股份有限公司；十二醇(分析級(jí))，阿拉丁生化科技股份有限公司；無(wú)水乙醇(分析級(jí))，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；濃HCl(分析級(jí))，開(kāi)封市芳晶化學(xué)試劑有限公司；異丙酮：分析級(jí)，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2　儀器與設(shè)備

Acton Spectra Pro500i 拉曼光譜儀,英國(guó)雷尼紹貿(mào)易有限公司；SHB-Ш 循環(huán)水式真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DZKW-D-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋,北京光明醫(yī)療器械廠；YP6102 電子天平,上海光正醫(yī)療儀器有限公司；LG10-2.4A高速離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1淀粉的純化

稱量100 g天然馬鈴薯淀粉置于500 mL的三口燒杯中，加入200 mL異丙酮純?nèi)芤?，上置冷凝管，加熱至沸騰后，回流30 min后，使用布氏漏斗進(jìn)行減壓抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇反復(fù)淋洗3～4次，收集濾餅，在室溫下晾干，得到純化淀粉。

1.3.2淀粉的酸解

使用1.3.1得到的純化淀粉制備酸解淀粉。將5.0 g馬鈴薯淀粉加入到100 mL 2.2 mol/L的HCl溶液中,配制成50 g/L的淀粉懸浮液,于35 ℃下進(jìn)行酸解7 d,用砂芯漏斗減壓抽濾,除去回收酸溶液,濾餅用去離子水抽濾洗滌多次,至pH值為7,殘余的固體物質(zhì)用乙醇和丙酮抽濾下淋洗2～4次,收集固體物質(zhì)并在室溫晾干備用[12]。

1.3.3B-型微晶的制備

使用1.3.2制得的酸解淀粉制備B-型微晶淀粉。將100 mL蒸餾水加入5.0 g酸性淀粉中制成50 g/L的淀粉溶液，加熱至80 ℃使淀粉溶解，然后冷卻，離心，上清液在-18 ℃條件下冷凍12 h，之后在室溫條件下解凍。解凍后只剩下少量冰，殘留物立即過(guò)濾，用冰水洗滌，室溫條件下干燥，最終得到B型微晶淀粉[10]。

1.3.4淀粉-醇類復(fù)合物的制備

將2.00 g B型微晶淀粉添加到500 mL的三口瓶中，加入40 mL蒸餾水，使用磁力攪拌器加熱，溫度為135 ℃，轉(zhuǎn)速1 360 r/min，上接回流裝置，待沸騰5 min后，緩慢向沸騰溶液中滴加正癸醇-乙醇溶液(一定量正癸醇溶于一定體積無(wú)水乙醇中)，繼續(xù)加熱10 min，轉(zhuǎn)移到一定溫度的恒溫水浴槽中，封口靜置一段時(shí)間，然后緩慢冷卻至室溫，放置24 h。離心分離，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀物，反復(fù)離心2次，得到白色沉淀物，冷凍干燥12 h，研磨，所得樣品即為直鏈淀粉-正癸醇復(fù)合物[13-14]。

直鏈淀粉-十二醇復(fù)合物的制備方法同1.3.4中直鏈淀粉-正癸醇復(fù)合物的制備方法，只需將正癸醇換成十二醇。

1.3.5樣品的X-射線(XRD)測(cè)試

取適量復(fù)合物樣品置于正方形托盤(pán)的圓形螺紋中(圓形直徑大小為約為10 cm，厚約為115 mm)，使用光滑的玻片壓平，用Burker D8型X射線衍射儀測(cè)定，所用波長(zhǎng)為0.154 2 nm的單色Cu-Kα射線。測(cè)試條件為：管壓40 kV，管流30 mA，掃描區(qū)域5°～35°，采樣步寬0.02°，掃描方式為連續(xù)，重復(fù)次數(shù)為1。

1.3.6樣品的拉曼光譜測(cè)試

拉曼光譜測(cè)試采用英國(guó)Renishaw的Inviaplus型顯微共聚焦拉曼光譜，激發(fā)光源為半導(dǎo)體激為532 nm，激光功率為50 mW，20倍長(zhǎng)焦物鏡背向散射測(cè)量模式，掃描次數(shù)20次，曝光時(shí)間為10 s。取少量樣品放入鋁杯中，使用100 mV的激光照射，在180°范圍內(nèi)收集散射輻射，波數(shù)范圍為100～3 250 cm-1[15]。

1.3.7數(shù)據(jù)處理

利用Origin6.1作圖軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、繪圖。使用 PeakFit v4.12對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分峰擬合處理。

2　結(jié)果與分析

2.1　淀粉樣品的XRD圖譜分析

圖1為馬鈴薯淀粉經(jīng)過(guò)一系列不同處理后的X-射線衍射圖。可以看出,原淀粉、酸解淀粉和重結(jié)晶淀粉在5.9°、17.1°、22.3°、24.0°附近存在較強(qiáng)的衍射峰，屬于B型結(jié)構(gòu)。d，e是B型微晶淀粉和正癸醇與十二醇的復(fù)合物，在7.8°、13.4°、20.9°處有尖銳的特征峰，呈現(xiàn)V型結(jié)構(gòu)。淀粉的B型結(jié)構(gòu)和V型結(jié)構(gòu)的晶型存在較大的差異。

a-馬鈴薯原淀粉; b-酸解淀粉; c-B型淀粉;d-淀粉-正癸醇復(fù)合物; e-淀粉-十二醇復(fù)合物圖1　不同處理方式所得的馬鈴薯淀粉XRD圖Fig.1　X-ray diffraction pattern of starch

2.2　不同結(jié)晶結(jié)構(gòu)淀粉樣品的拉曼圖譜解析

不同結(jié)晶結(jié)構(gòu)的馬鈴薯淀粉拉曼光譜圖及圖譜分析見(jiàn)圖2和表1?？梢钥闯?，樣品出現(xiàn)的散射特征峰位置一致。從原淀粉到直鏈淀粉與正癸醇復(fù)合過(guò)程中，拉曼光譜特征峰強(qiáng)度逐步下降。其中，酸解過(guò)程中，峰強(qiáng)度變化非常大。原淀粉中含有大量的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使得峰強(qiáng)度很高，酸解后，峰強(qiáng)度極大地降低，是因?yàn)樵谒峤膺^(guò)程中，很多無(wú)序排列結(jié)構(gòu)被除去，分子變得有序，構(gòu)象的數(shù)量減少，導(dǎo)致了峰強(qiáng)度的降低。其次，重結(jié)晶過(guò)程中，峰強(qiáng)度進(jìn)一步降低，1 120 cm-1處的特征峰變緩，呈圓包凸出狀，近乎消失，是因?yàn)樵谶@個(gè)過(guò)程中，有序的淀粉在熱水中加熱時(shí)，變得無(wú)序，然后冷卻時(shí)，無(wú)序的結(jié)構(gòu)發(fā)生重結(jié)晶，再聚集成有序結(jié)構(gòu)，2種有序結(jié)構(gòu)是不同的，在這個(gè)過(guò)程中，水分滲出，結(jié)晶度增加，B型微晶形成，故兩者的拉曼光譜也表現(xiàn)出了較大的差異。這與前人[9]的研究結(jié)果一致。直鏈淀粉與正癸醇復(fù)合過(guò)程中，475.534、938.91、2 909.45 cm-1處的峰再次降低，這是非晶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成結(jié)晶結(jié)構(gòu)的結(jié)果。此外，復(fù)合后，2 909.45 cm-1處的光譜波形不變，峰頂部變得狹窄，這是由于正癸醇分子進(jìn)入單螺旋，與淀粉微晶復(fù)合。2種復(fù)合物的峰形基本一致，強(qiáng)度上相差較大，直鏈淀粉-十二醇復(fù)合物在2 909.45 cm-1處的峰強(qiáng)度達(dá)到17 800.70，而直鏈淀粉-正癸醇復(fù)合物的峰強(qiáng)度是8 099.46。在入射光相同的情況下，出現(xiàn)峰強(qiáng)度的差異，可能與配體的差異或不同的復(fù)合條件有關(guān)。從整體上看，不同晶型淀粉的結(jié)構(gòu)有很大差異，這印證了X-衍射得到的結(jié)果。

a-馬鈴薯淀粉; b-酸解淀粉; c-B型微晶淀粉; d-直鏈淀粉-正癸醇復(fù)合物;e-直鏈淀粉-十二醇復(fù)合物圖2　不同結(jié)構(gòu)淀粉的拉曼光譜與局部拉曼光譜Fig.2　Raman spectra and the local Raman spectra of starch

樣品特征衍射峰強(qiáng)度475.534cm-1938.91cm-11337.09cm-12909.45cm-1馬鈴薯淀粉12579.507913.758123.3833029.10酸解淀粉6005.333791.753955.4214902.70B型微晶淀粉3273.342253.031915.508378.17直鏈淀粉-正癸醇復(fù)合物2658.581790.692584.248099.46直鏈淀粉-十二醇復(fù)合物4961.624442.476485.2317800.70

不同結(jié)晶結(jié)構(gòu)的馬鈴薯淀粉拉曼特征振動(dòng)對(duì)比見(jiàn)表2。拉曼光譜中圖譜基線的高低對(duì)應(yīng)于樣品中熒光性雜質(zhì)的含量。從表2中可以看出，經(jīng)過(guò)一系列不同的處理后，不同結(jié)構(gòu)的拉曼光譜位置，除少數(shù)發(fā)生輕微偏移外，主要的散射特征峰基本無(wú)變化，特征峰強(qiáng)度逐步降低，這可能是由于淀粉的進(jìn)一步提純導(dǎo)致，在每一步處理中，淀粉經(jīng)過(guò)了蒸餾水和無(wú)水乙醇的多次洗滌，除去了大部分的熒光性雜質(zhì)，使淀粉的基線不斷降低。淀粉-十二醇復(fù)合物各峰值強(qiáng)度增大，可能是由于配體不同。馬鈴薯原淀粉在815 cm-1處有峰，而其他3種消失。476.62 cm-1處的峰是由吡喃糖環(huán)中C—O—C的骨架振動(dòng)和δ(C—C—O)引起，表示的是多糖的聚合度，是淀粉的特征峰[16]，峰強(qiáng)度比2 909.45 cm-1處C—H伸縮的峰強(qiáng)度低。861.84 cm-1處的峰來(lái)源于C—O—C環(huán)和C1—H彎曲振動(dòng)，938.91 cm-1處是α-(1→4)糖苷鍵的C—O—C的彎曲振動(dòng)引起[17-18]。

表2　不同結(jié)構(gòu)淀粉的拉曼特征振動(dòng)對(duì)比Table 2　Raman characteristic vibration of starch

注：a, b分別表示左偏移，右偏移；*表示該處光譜消失。

2.3　800～1 500 cm-1圖譜區(qū)淀粉結(jié)構(gòu)分析

對(duì)不同處理后的淀粉樣品的吸收峰進(jìn)行分峰,可以獲得淀粉的每個(gè)官能團(tuán)的吸收峰及其峰面積。不同結(jié)構(gòu)淀粉800～1 500 cm-1分峰圖譜見(jiàn)圖3。平滑度SM設(shè)定7.19%，基線誤差限tol設(shè)定3.0%，掃描放大值A(chǔ)mp設(shè)定1.50%，擬合度R達(dá)到97.9%。圖3上側(cè)曲線是經(jīng)過(guò)擬合后的譜線，下側(cè)曲線為擬合分離出的譜線，將圖3中各特征峰曲線進(jìn)行分析處理，計(jì)算800～1 500 cm-1內(nèi)的吸收峰相對(duì)峰面積列于表3中[19]。為了消除檢測(cè)過(guò)程中因處理方式不同帶來(lái)的峰面積的不可比性,以1 033，1 085.9，1 131.2 cm-1處吸收峰面積之和為標(biāo)準(zhǔn)峰來(lái)計(jì)算800～1 500 cm-1

圖3　淀粉樣品的分峰圖譜Fig.3　Raman spectra of starch samples by peakfit

內(nèi)各吸收峰的相對(duì)峰面積。計(jì)算公式為：

(1)

式中：Rx，X位置處吸收峰相對(duì)峰面積；Px，分峰所得X位置處吸收峰面積；P標(biāo)，分峰所得1 033，1 085.9，1 131.2 cm-1處吸收峰總面積。

表3　peakfit分峰擬合后所得拉曼吸收峰的相對(duì)峰面積Table 3　Relative peak areas of starch samples by peakfit

由圖3和表3可知，處理后得到的不同淀粉，經(jīng)過(guò)分峰擬合后，峰位置基本不變，擬合峰分別出現(xiàn)在856.13、931、1 033、1 085.9、1 131.2、1 213.7、1 261.3、1 336.1、1 388.9、1 455 cm-1等處，1 131.2，1 336.1 cm-1處的峰與淀粉的單螺旋結(jié)構(gòu)相關(guān)，淀粉與配體復(fù)合時(shí)，雙螺旋解旋為左手單螺旋結(jié)構(gòu)[20]，使復(fù)合物中單螺旋結(jié)構(gòu)增加，表現(xiàn)為1 131.2、1 336.1 cm-1處相對(duì)峰面積增大。在800～1 500 cm-1之間，兩種復(fù)合物也可以擬合成10個(gè)峰，且相對(duì)峰面積大致相同，可以看出復(fù)合過(guò)程對(duì)該處影響不大。

2.4　2 909.45 cm-1處淀粉結(jié)構(gòu)分析

對(duì)2 909.45 cm-1處的拉曼光譜進(jìn)行分峰處理，不同結(jié)構(gòu)淀粉的分峰圖譜見(jiàn)圖4。

平滑度SM設(shè)定2.96%，基線誤差限tol設(shè)定3.0%，掃描放大值A(chǔ)mp設(shè)定1.50%，擬合度R達(dá)到97.9%。將圖4中各特征峰曲線進(jìn)行分析處理，計(jì)算各吸收峰相對(duì)峰面積列于表4。以2 911，2 965 cm-1處特征峰面積之和為標(biāo)準(zhǔn)峰來(lái)計(jì)算各吸收峰的相對(duì)峰面積，計(jì)算公式同式(1)。

由圖4和表4可知，經(jīng)過(guò)分峰擬合后，樣品的峰位置基本不變，擬合峰分別出現(xiàn)在2 911 cm-1和2 965 cm-1等處，其中原淀粉，酸解淀粉和B型淀粉的相對(duì)峰面積基本一致，均為0.34左右，復(fù)合物的相對(duì)峰面積為0.40左右。復(fù)合后，在2 965 cm-1處的分峰面積增大。因此，復(fù)合過(guò)程對(duì)2 909.45 cm-1處的峰影響較大。淀粉-十二醇復(fù)合物的峰面積大，可能與配體鏈長(zhǎng)有關(guān)，即鏈越長(zhǎng)，該配體復(fù)合物在2 965 cm-1處的峰面積越大。

圖4　五種不同結(jié)構(gòu)淀粉的分峰圖譜Fig.4　Raman spectra of starch by peakfit

樣品特征衍射峰面積2911cm-12965cm-1相對(duì)峰面積R脫脂原淀粉2.14×1061.125×1060.34酸解淀粉7.17×1053.73×1050.34B型微晶淀粉4.16×1052.23×1050.35淀粉-正癸醇復(fù)合物3.34×1052.07×1050.38淀粉-十二醇復(fù)合物5.36×1053.83×1050.42

3　結(jié)論

X-衍射圖譜表明，馬鈴薯原淀粉、酸解馬鈴薯淀粉和B型淀粉微晶均為B型結(jié)構(gòu)，復(fù)合物為V型結(jié)構(gòu)。以馬鈴薯淀粉為原料，對(duì)比不同結(jié)晶結(jié)構(gòu)淀粉的拉曼光譜，結(jié)果表明，從原淀粉到直鏈淀粉與正癸醇復(fù)合過(guò)程中，拉曼光譜特征峰強(qiáng)度逐步下降。

對(duì)比不同醇的復(fù)合物，不同復(fù)合物的特征峰位置基本一致，強(qiáng)度上相差較大，可能是由于配體差異或條件的不同。使用PeakFit v4.12對(duì)拉曼散射峰進(jìn)行分峰處理。分峰擬合的相對(duì)峰面積也發(fā)生了變化，淀粉與配體復(fù)合時(shí)，雙螺旋解旋為左手單螺旋結(jié)構(gòu)，使復(fù)合物中單螺旋結(jié)構(gòu)增加，表現(xiàn)為1 131.2 cm-1和1 336.1 cm-1處相對(duì)峰面積增大。2 965 cm-1處醇復(fù)合物的相對(duì)峰面積隨配體鏈長(zhǎng)的增大而增大。

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