石榴枸杞酒發(fā)酵工藝的響應(yīng)面優(yōu)化分析

吳昊，李秀秀

1(徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州，221140)2(中國礦業(yè)大學(xué) 化工工程學(xué)院，江蘇 徐州，221116)

本研究旨在將石榴與枸杞混合發(fā)酵，加入酵母菌,以充分利用果汁中的糖分生成酒精，并將石榴和枸杞中的營養(yǎng)成分溶出，充分汲取了兩者的活性有效成分。此酒因石榴、枸杞本身特有的清香和發(fā)酵后和諧的酒香使其風(fēng)味突出，又綜合利用原料中的石榴汁和枸杞汁中固有的豐富顏色，釀制成芳香醇厚、顏色鮮亮的果酒。因此，這既能充分利用石榴枸杞的資源，增加它們的附加價值，又能促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，順應(yīng)了當(dāng)前酒類行業(yè)的發(fā)展趨向[1-2]。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

軟籽石榴：徐州賈汪；枸杞：寧夏；酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：太古糖業(yè)有限公司；果膠酶(生化級)：江蘇銳陽生物科技有限公司；二氧化硫 (食品級)：法國進(jìn)口。

1.2　儀器與設(shè)備

料理機(jī)，九陽股份有限公司；DZG-6090電熱真空干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；HH-S8電熱恒溫水浴鍋，常州市萬合儀器制造有限公司；WYT-J手持式糖度計，杭州生物科技有限公司；酒精計，河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠；BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；GTR22-1高速冷凍離心機(jī)，北京時代北利離心機(jī)有限公司；UV-2000紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。

1.3　方法

1.3.1 石榴枸杞酒的工藝流程

1.3.2石榴汁的制作

挑選個大、無損壞的石榴，去掉外皮和內(nèi)種皮，用清水清洗數(shù)次，按照V(石榴)∶V(水)=1∶1的比例加水，放入料理機(jī)進(jìn)行榨汁[3]。

1.3.3枸杞汁的制作

挑選個大、果肉肥厚無霉變的枸杞果，用清水清洗數(shù)次，按照V(枸杞)∶V(水)=2.5∶1的比例加水，浸泡3 h，放入料理機(jī)進(jìn)行榨汁[3]。

1.3.4石榴枸杞汁成分調(diào)配

將兩種果汁按照一定比例混合200 mL放入發(fā)酵瓶中，用移液管吸取5 mL，在離心機(jī)3 600 r/min下離心10 min之后，用移液管移取上清液并測量其糖度及酸度，按每17 g/L的糖能產(chǎn)生1%vol酒精調(diào)整糖度，用白砂糖調(diào)整糖度，使糖度達(dá)到25%，用檸檬酸調(diào)pH在3.1～3.8之間即可[4-5]。

1.3.5混合原料預(yù)處理

將成分調(diào)配好的果汁混合液，加入一定量的SO2和果膠酶，接入活化酵母[6-9]。

1.3.6發(fā)酵工藝單因素試驗

將混合原料成分調(diào)配好后，接入酵母，發(fā)酵時間為6 d，考察石榴枸杞汁比、酵母量以及發(fā)酵溫度等3個因素對石榴枸杞酒酒精度的影響，探討單因素的最佳工藝參數(shù)。

1.3.7響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝

根據(jù)單因素實驗，設(shè)計了石榴枸杞汁比、酵母量與發(fā)酵溫度3個因素3個水平進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗[10-13]。試驗因素水平見表1。

表1　響應(yīng)面試驗因子水平編碼表Table 1　Factors and levels of response surface experiments

1.3.8果汁理化指標(biāo)和酒精度的測定

按《GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法測定果汁中的總糖、總酸、可溶性固形物等指標(biāo)以及發(fā)酵酒酒精度。

1.3.9后發(fā)酵處理

前發(fā)酵結(jié)束后，將上部清液轉(zhuǎn)入另一個已滅過菌的發(fā)酵瓶中，與酵母及酒腳等沉淀物分離，在16～20 ℃下發(fā)酵30 d。

1.3.10發(fā)酵酒多酚類化合物的含量測定

因石榴中含有多種多酚類活性物質(zhì)，是保健酒中重要的活性成分，因此檢測分析發(fā)酵酒中的多酚類化合物含量可作為保健酒質(zhì)量的評判標(biāo)準(zhǔn)。本試驗選擇沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用Folin-Ciocalteu比色法進(jìn)行測定[17]。

1.3.11發(fā)酵酒多糖的含量測定

由于枸杞中含有枸杞多糖的活性物質(zhì)，具有抗氧化性，增強(qiáng)人體免疫力功效，因此檢測分析發(fā)酵酒中的多糖含量，可作為保健酒質(zhì)量的評判標(biāo)準(zhǔn)。本試驗選擇以葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)品，用硫酸-苯酚比色法進(jìn)行測定[18]。

2　結(jié)果與分析

2.1　果汁理化指標(biāo)

參照國家GB/T15038—2006 標(biāo)準(zhǔn)，對石榴汁及枸杞汁的理化指標(biāo)進(jìn)行檢測。石榴汁：總糖11%，有機(jī)酸(以檸檬酸汁)0.62%；可溶性固形物13%；枸杞汁：總糖13%，有機(jī)酸(以檸檬酸汁)0.57%，可溶性固形物15%。石榴汁和枸杞汁中含有的總糖和可溶性固形物較為豐富，適合作為原料發(fā)酵。

2.2　石榴枸杞汁比對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響

取經(jīng)處理好的石榴枸杞汁，在酵母量4%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時間6 d的條件下，考察不同石榴枸杞汁比對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響(圖1)。

圖1　石榴枸杞汁比對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響Fig.1　Influence of juice ration on pomegranateandmedlarfermentation wine

當(dāng)石榴枸杞汁之比為2∶1(V∶V)時酒精度達(dá)到最高，可能是因為此時的石榴枸杞混合汁的滲透壓較適合釀酒酵母的生長，因此酵母代謝產(chǎn)生酒精含量高[19]。當(dāng)逐漸增加石榴汁的比例時，由于石榴汁相比較枸杞汁來說含糖量較低，因此補(bǔ)加的白砂糖愈多，可能對發(fā)酵過程產(chǎn)生消極的影響愈明顯，當(dāng)超過2∶1(V∶V)時酒精度呈下降趨向，這與添加白砂糖可能會影響到酵母的正常生長和代謝有關(guān)。因此，選擇石榴枸杞汁比1∶1、2∶1、3∶1(V∶V)做石榴枸杞酒響應(yīng)面分析以確定最佳汁液比。

2.3　酵母量對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響

取經(jīng)處理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁比為2∶1(V∶V)，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時間6 d的條件下，考察不同酵母量對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響(圖2)。

圖2　酵母量對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響Fig.2　Influence of yeast inoculation quantity onpomegranateandmedlar fermentation wine

由圖2可知，隨酵母量的增加酒精度增加，糖度則相應(yīng)的減少，因為酵母量越多，越有利于糖向酒精產(chǎn)物方向轉(zhuǎn)化，但當(dāng)酵母量超過3%時，酒精度反而減小，可能是因為酵母量過多，導(dǎo)致微生物繁殖過快而造成底物營養(yǎng)缺乏，微生物產(chǎn)生激烈的競爭，從而影響微生物生長發(fā)酵[20]。酵母量超過3%時，由于營養(yǎng)源不足造成發(fā)酵酒中的含糖量略微增加，因此選擇酵母接種量為2%、3%、4%做石榴枸杞酒響應(yīng)面分析以確定酵母最佳添加量。

2.4　發(fā)酵溫度對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響

取處理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁比為2∶1(V∶V)，酵母量4%，發(fā)酵時間6 d的條件下，考察不同發(fā)酵溫度對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響。

由圖3可知，發(fā)酵溫度不斷升高,酒精度也不斷增加，溫度到達(dá)26 ℃時酒精度達(dá)到最大值，而糖度為最小值，溫度超過26 ℃酒精度呈下降趨向，這是因為發(fā)酵溫度對酵母菌的生長繁殖有重要的影響，溫度低于26 ℃，此時沒有達(dá)到酵母菌的最適生長溫度，酵母菌生長繁殖較慢，隨著溫度的升高，酵母菌成長速度逐漸加快，26 ℃時生長繁殖最快，新陳代謝旺盛，產(chǎn)酒精量高。當(dāng)溫度超過26 ℃時，此時影響了酵母菌的生產(chǎn)繁殖，代謝降低，酒精度降低，所以選擇溫度24、26、28 ℃做石榴枸杞酒響應(yīng)面分析以確定最佳發(fā)酵溫度。

圖3　發(fā)酵溫度對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響Fig.3　Influence of temperature on pomegranateand medlar fermentation wine

2.5　響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件

2.5.1回歸模型的建立及方差分析

石榴枸杞酒發(fā)酵工藝的響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果見表2。通過Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行實驗?zāi)Ｐ偷幕貧w分析，并對石榴和枸杞酒發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行預(yù)測。方差分析的結(jié)果見表3。

對表2中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，得到各因素水平對石榴枸杞酒酒精度(Y)影響的二次多項回歸模型方程：

Y=9.53+0.044A-0.17B+0.57C-0.058AB-0.43AC+0.045BC-1.08A2-0.44B2-0.21C2

(1)

表2　Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2　Results of Box-Behnken central composite design

表3　響應(yīng)面結(jié)果的方差分析Table 3　Variance analysis of response surface methodology

2.5.2響應(yīng)面分析及優(yōu)化

結(jié)合公式(1)，采用Design Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面分析圖。圖4～圖6直觀反映了各因素間的交互作用對石榴枸杞酒酒精度的影響[22]。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)規(guī)律，A、B、C各因素所對應(yīng)的F值越大表明該因素對響應(yīng)值的影響就越大，因此可知各因素對酒精度影響的主次順序:最大的是發(fā)酵溫度，其次是石榴枸杞汁比，最后是酵母接種量。由軟件分析得最佳工藝參數(shù)：發(fā)酵溫度28 ℃、石榴枸杞汁比1.87∶1(V∶V)、酵母菌接種量2.82%，此時乙醇體積分?jǐn)?shù)的預(yù)測值Y 為9.935 28%(vol)。考慮實際操作性，將發(fā)酵工藝參數(shù)修正為發(fā)酵溫度28 ℃、石榴枸杞汁比2∶1、酵母菌接種量3%。

圖4～圖6表明，石榴枸杞汁比和酵母接種量交互作用對石榴枸杞酒酒精度的影響顯著度不大，而發(fā)酵溫度和酵母接種量交互作用對石榴枸杞酒酒精度的影響非常明顯，偏高或偏低的發(fā)酵溫度以及酵母接種量都會使石榴枸杞酒酒精度降低[23]。

圖5　接種量與發(fā)酵溫度因素相互作用的等高線和響應(yīng)面Fig.5　Contour and response for the alcoholicity under factorinoculation quantity and temperature interaction

圖6　石榴枸杞汁比與發(fā)酵溫度因素相互作用的等高線和響應(yīng)面Fig.6　Contour and response for the alcoholicity under factorration on pomegranate-medlarjuice and temperature interaction

2.5.3驗證性試驗

在最優(yōu)發(fā)酵條件下，石榴枸杞酒酒精含量的理論預(yù)測值為9.93%vol。為驗證試驗結(jié)果的可靠性，采用最佳發(fā)酵條件對石榴枸杞酒進(jìn)行發(fā)酵試驗，測試結(jié)果如表6所示。由表6可以看出，3 組平行試驗的結(jié)果分別為9.92%vol、9.94%vol、9.95%vol，平均值為9.94%vol，RSD值僅為0.15%。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化石榴枸杞酒發(fā)酵工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，具有一定的實用價值[24]。

表6　最佳發(fā)酵工藝試驗結(jié)果Table 6　Test results of the optimum fermentation process

3　結(jié)論

通過單因素試驗和中心組合設(shè)計試驗，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化石榴枸杞發(fā)酵工藝條件，建立石榴枸杞酒發(fā)酵工藝的二次多項數(shù)學(xué)模型。該模型極顯著，擬合情況較好，可用來預(yù)測設(shè)定條件范圍內(nèi)石榴枸杞酒發(fā)酵工藝參數(shù)，有一定的實用價值。各因素對石榴枸杞酒發(fā)酵工藝的影響次序為發(fā)酵溫度>石榴枸杞汁比>酵母接種量，優(yōu)化后工藝條件參數(shù)為發(fā)酵溫度28 ℃、石榴枸杞汁比2∶1(V∶V)、酵母菌接種量3%。在此條件下，產(chǎn)品酒精度可達(dá)9.94%vol，發(fā)酵所得的石榴枸杞酒香純厚，酒味突出，顏色為棕紅色，有光澤，透明度高，無苦澀味。經(jīng)檢測，該酒符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 2758—2012發(fā)酵酒及其配制酒》，酒體中含有豐富的活性物質(zhì)，多酚類化合物含量200 mg/L，多糖含量達(dá)1.15 g/L，具有防治心血管疾病及增強(qiáng)人體免疫能力等保健功效[25]，是一種營養(yǎng)豐富的保健型發(fā)酵酒，開發(fā)前景廣闊。

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