蔗糖硬脂酸酯組成與功能特性的關(guān)系及其酶催化合成

馬亞茹，藍(lán)平，汪勇，晏日安

(暨南大學(xué)，食品科學(xué)與工程系，廣東高校油脂生物煉制工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州，510000)

蔗糖硬脂酸酯是由蔗糖與硬脂酸或硬脂酸酯通過酯化或酯交換反應(yīng)生成的非離子型表面活性劑[1]，無毒無味且易被生物降解，具有良好的乳化性、分散性、抗菌性等特點[2-4]，可作為乳化劑、殺菌劑[5]等被廣泛應(yīng)用于食品、藥品中[6]。目前，市場上使用較為廣泛的蔗糖酯為日本三菱化學(xué)株式會社研發(fā)的L、P、S系列產(chǎn)品。不同型號的蔗糖酯由不同組分含量的蔗糖脂肪酸單、雙、多酯組成，其中S系列蔗糖硬脂酸酯因其較寬的HLB值及其特有的物化性能被大量應(yīng)用于人造奶油、糖果、飲料等生產(chǎn)中[7]。作為一種O/W型表面活性劑，蔗糖硬脂酸酯的HLB值、起泡性能和乳化性能與其單、雙、多酯的組分含量密切相關(guān)[8]，因此研究其各組分含量、HLB值與其功能特性的關(guān)系對于蔗糖硬脂酸酯的合成方向以及深入拓展蔗糖硬脂酸酯在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用具有重要意義。

蔗糖硬脂酸酯一般通過化學(xué)法和酶催化合成[9]，依據(jù)日本部分公開的專利，S系列蔗糖酯是通過化學(xué)法合成，產(chǎn)物一般由單、雙、多酯組成，特異選擇性地取代羥基較為困難，而單酯含量對于蔗糖硬脂酸酯的HLB值、起泡性能及乳化性能起到重要作用。酶催化合成較化學(xué)合成反應(yīng)條件溫和、特異選擇性強(qiáng)且綠色安全[10-11]。目前在酶法合成中采用的底物一般為葡萄糖、果糖或乳果糖和中、低碳鏈長度的酸(如醋酸、己酸、辛酸、月桂酸)及其酯類[12-14]，以蔗糖和長鏈脂肪酸為底物的合成方法較為少見。而目前應(yīng)用脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯的困難在于蔗糖親水性強(qiáng)，?；w如長鏈脂肪酸屬于疏水性物質(zhì)[15]，單一溶劑通常不能使二者混溶；在酶催化合成中，脂肪酶在極性較大或含水量較高的情況下會出現(xiàn)部分甚至完全失活的現(xiàn)象[16-18]。因此，如何利用綠色高效的脂肪酶以及合適的反應(yīng)體系催化蔗糖與硬脂酸或硬脂酸酯合成蔗糖硬脂酸酯，對于我國優(yōu)質(zhì)乳化劑研發(fā)及打破國外技術(shù)壟斷具有重要意義。

本課題以日本三菱化學(xué)株式會社S系列5種不同型號的商品蔗糖硬脂酸酯為研究對象，探究其單、雙、多酯含量與HLB值之間的變化規(guī)律，及其起泡性能和乳化性能與HLB值、組分含量之間的關(guān)系；在此基礎(chǔ)之上，以蔗糖和硬脂酸乙酯為底物，在叔戊醇∶丙酮∶DMSO混合體系中，克服反應(yīng)底物在單一體系中溶解度較低及因極性而引起脂肪酶失活的缺點，采用TLIM固定化脂肪酶，催化合成蔗糖硬脂酸單酯，同時測定其HLB值、物化性能，對于拓展蔗糖硬脂酸酯的應(yīng)用及其合成具有重要意義。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

S系列蔗糖硬脂酸酯，日本三菱化學(xué)株式會社；TLIM脂肪酶(250 IUN/g)，諾維信生物技術(shù)有限公司；蔗糖、硬脂酸乙酯、叔戊醇、二甲基亞砜，阿拉丁試劑有限公司；氘代-甲醇，Cambridge Isotope Laboratories；其他試劑均為分析純。

1.2　儀器與設(shè)備

LC-20 A高效液相色譜儀，日本島津公司；EQUINOX-55型紅外光譜儀，布魯克光譜儀器公司；4 000 Q Trap質(zhì)譜儀，AB SCIEX公司；AVANCEIII型核磁共振波譜儀，500 MHz，瑞士布魯克公司；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，東京理化器械株式會社。

1.3　方法

1.3.1S系列蔗糖硬脂酸單、雙、多酯含量的測定

采用高效液相色譜法測定。配制1.00 g/L的系列蔗糖硬脂酸酯S-570, S-770, S-970, S-1 170, S-1 570甲醇溶液，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣，根據(jù)出峰時間進(jìn)行組分定性，采用面積歸一法進(jìn)行定量[19]。

色譜條件：根據(jù)RITTHITHAM[8]、WANG[19]的方法略有改動。色譜柱為ECOSIL-C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)，進(jìn)樣量20 μL，流速為1 mL/min，柱溫為40 ℃；載氣流速 2.4 L/min，壓力5.0 kPa,空氣溫度85 ℃，甲醇和水梯度洗脫(見表1)。

表1　流動相洗脫梯度Table 1　Elution gradient of mobile phase

1.3.2水?dāng)?shù)法測定HLB值

水?dāng)?shù)法是測定HLB值常用的一種方法，水?dāng)?shù)是使一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的表面活性劑的有機(jī)溶液呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)所需蒸餾水的體積。采用水?dāng)?shù)法根據(jù)Span 85, Span 60, Span 40, Span 20, Tween 80的HLB值及其所用蒸餾水體積(mL)繪制HLB值與水?dāng)?shù)的關(guān)系圖。測定方法根據(jù)文獻(xiàn)修改如下[20-21]：

25 ℃條件下取1.00 g系列蔗糖硬脂酸酯溶于25 mLN,N-二甲基甲酰胺和苯(體積比100∶5)的混合液中，磁力攪拌下緩慢滴加蒸餾水，直至溶液由無色透明變?yōu)椴煌说哪：咨胪该鳡顟B(tài)，記錄蒸餾水體積(mL)。根據(jù)HLB值與水?dāng)?shù)(mL)關(guān)系圖，得出參考方程，計算系列蔗糖硬脂酸酯的HLB值。

1.3.3起泡性能的測定

25 ℃下分別配置質(zhì)量濃度1.00 g/L的系列蔗糖硬脂酸酯-水溶液于刻度試管中，記錄溶液起始高度。轉(zhuǎn)速n=3500，分散均質(zhì)2 min，記錄試管中泡沫和液體總高度；靜置10 min后記錄泡沫和液體總高度[22-23]。起泡能力和泡沫穩(wěn)定性計算：

(1)

(2)

1.3.4乳化性能的測定

25 ℃下分別配置質(zhì)量濃度為2.50 g/L的系列蔗糖硬脂酸酯-水溶液，調(diào)節(jié)pH至7，與5 mL的花生油在23 500 r/min下均質(zhì)1 min, 然后在3 630 r/min下離心25 min。記錄試管中乳化層的高度和乳化液總高度。將乳化液于80 ℃水浴30 min，冷卻至室溫后于3 630 r/min下離心25 min，記錄乳化層的高度[24]。乳化能力和乳化穩(wěn)定性計算公式如下：

(3)

(4)

1.3.5蔗糖硬脂酸酯的合成

有機(jī)溶劑用4 ?分子篩除水72 h。10.00 mL[V(叔戊醇)∶V(丙酮)=7∶3]體系中加入0.30 mL DMSO，0.03 g十四烷基三甲基溴化銨[25]，45 ℃條件下將蔗糖(1.00 mmol)與硬脂酸乙酯(6.00 mmol)加入50.00 mL具塞錐形瓶中，溶解均勻，加入0.20 g Novozymes TLIM脂肪酶，球形冷凝管置錐形瓶上端，于恒溫振蕩式搖床中反應(yīng)。反應(yīng)過程通過薄層色譜法監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析純化，旋蒸洗脫液并真空干燥得白色固體。

1.3.6產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

1H-NMR、13C-NMR：氘代甲醇為溶劑，四甲基硅為內(nèi)標(biāo)，25 ℃下分別采用500 MHz和150 MHz進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

質(zhì)譜測定條件：ESI離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度200 ℃；采用負(fù)離子模式；母粒子m/z330；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍0～1 000m/z。

1.3.7產(chǎn)物HLB值、起泡性能和乳化性能的測定

根據(jù)HLB值與水?dāng)?shù)關(guān)系圖得出的參考方程計算產(chǎn)物的HLB值；配置一系列不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的產(chǎn)物-水溶液，分別測定起泡能力、泡沫穩(wěn)定性[22-23]，乳化能力、乳化穩(wěn)定性[24]，并與S系列蔗糖硬脂酸酯進(jìn)行對比分析。

1.4　數(shù)據(jù)分析處理

實驗3次平行，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行計算、相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)計算部分以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2　結(jié)果與分析

2.1　HLB值與水?dāng)?shù)(mL)關(guān)系

HLB值是衡量表面活性劑的親水親油能力強(qiáng)弱的主要指標(biāo)，也可作為選擇表面活性劑的重要依據(jù)[26]。根據(jù)所選擇的Span 85, Span 60, Span 40, Span 20, Tween 80標(biāo)準(zhǔn)品的HLB值以及用水?dāng)?shù)法測得的蒸餾水體積(mL)，得到標(biāo)準(zhǔn)品與水?dāng)?shù)的關(guān)系圖如圖1所示，模擬參考方程為y=0.41e0.1674x，為測得S系列蔗糖硬脂酸酯的HLB值提供依據(jù)。

圖1　HLB值與水體積關(guān)系Fig.1　The relationship between HLB value andvolume of water

2.2　S系列單、雙、多酯含量與HLB值的關(guān)系

蔗糖分子結(jié)構(gòu)中存在8個自由羥基，其中位于6，6’，1’位上的3個一級羥基反應(yīng)活性最高，易被酯化，而其余的5個二級羥基較難參與酯化反應(yīng)[14]。此外，隨蔗糖中羥基被取代的位點、數(shù)量的變化，其單、雙、多酯的比例隨之改變并最終導(dǎo)致HLB值的差異[27]。蔗糖硬脂酸單、雙、多酯酯化度不同，極性也會不同，在HPLC條件下各成分組峰的保留時間隨流動相極性變化而變化，因此可對各組分含量用面積歸一法進(jìn)行定量。如表2所示，單酯含量升高，HLB值隨之升高，其親水性增大。當(dāng)HLB值由14.73降至8.83時，其單酯含量下降約21.61%，二酯含量上升約53.11%；在HLB值由8.83降低至5.47時，其單酯含量下降約53.66%，二酯含量下降約1.86%，多酯由7.66%急劇增加至37.36%，此區(qū)間是由二酯和多酯的協(xié)同作用而導(dǎo)致不同的HLB值。二酯和多酯含量的增加是由于隨著反應(yīng)時間及反應(yīng)條件的變化，取代6—OH的蔗糖酯會被繼續(xù)取代6’—OH和1’—OH以及其他號位的羥基繼續(xù)生成二酯或者多酯，從而引起其親水親油平衡能力的變化。

表2　單、雙、多酯含量與HLB值的關(guān)系Table 2　The relationship between content of Mono-,Di-,Poly-ester and HLB value

由表3可知，HLB值與單酯含量呈正向相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.944，在0.05水平上為顯著相關(guān)，與二酯和多酯含量呈反向相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.657和-0.810。由此可知單酯含量的變化是決定HLB值的關(guān)鍵因素，同時，單酯與二酯、多酯含量的協(xié)同作用引起HLB值的變化。

表3　HLB值與單、雙、多酯含量的相關(guān)性分析Table 3　Correlation analyses between HLB value andcontent of Mono-, Di-, Poly-ester

*在0.05水平上雙側(cè)顯著相關(guān)。

2.3　起泡性能與HLB值的關(guān)系

如圖2所示，本研究所采用的S系列蔗糖硬脂酸酯作為表面活性劑起泡能力最高約為21%，與文獻(xiàn)[28]顯示的蔗糖硬脂酸酯起泡力小的研究基本一致，其泡沫穩(wěn)定性最高約為80%。

圖2　起泡能力和起泡穩(wěn)定性與HLB值的關(guān)系Fig.2　The relationship between foamability,foaming stability and HLB value

隨著HLB值減小，其起泡力和泡沫穩(wěn)定性隨之下降。其中泡沫穩(wěn)定性在HLB值由7.73降低至5.47時下降程度較大，原因在于除單酯和二酯及多酯在界面相互作用，降低了排液速度之外，還由于更多的多酯加入表面，使表面乳化層起泡排列不夠緊密，膜強(qiáng)度相應(yīng)變小，縮短了泡沫液膜破裂的時間，降低了泡沫的穩(wěn)定性。

2.4　乳化性能與HLB值的關(guān)系

如圖3所示，蔗糖硬脂酸酯隨HLB值減小，其乳化能力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在HLB為8.83時達(dá)到最大值，乳化穩(wěn)定性隨單酯含量降低而降低。乳化劑的乳化能力根據(jù)其減少油水界面張力和擴(kuò)散到新生成的界面能力的不同而不同[20]，油水界面張力與擴(kuò)散到新生成界面的能力與蔗糖酯中單、雙、多酯的比例存在顯著關(guān)系。實驗結(jié)果表明在HLB為8.83時所對應(yīng)的單、雙、多酯的比例為使此蔗糖硬脂酸酯產(chǎn)品顯現(xiàn)出較高的乳化能力。

圖3　乳化能力和乳化穩(wěn)定性與HLB值的關(guān)系Fig.3　The relationship between emulsibility,emulsibility stability and HLB value

2.5　HLB值與起泡性能、乳化性能的相關(guān)性分析

HLB值與起泡性能、乳化性能的相關(guān)系數(shù)如表4所示，HLB值與起泡能力在0.01水平上雙側(cè)顯著相關(guān)，與泡沫穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性在0.05水平上雙側(cè)顯著相關(guān)，與乳化能力呈正向相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.864。HLB值變化是由單酯、二酯、多酯含量協(xié)同作用產(chǎn)生的結(jié)果，由表4中相關(guān)系數(shù)可知，蔗糖硬脂酸酯組分含量與起泡能力關(guān)系更為密切，是決定起泡能力的重要因素，與泡沫穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性也呈顯著相關(guān)。

表4　HLB值與起泡性能、乳化性能的相關(guān)性分析Table 4　Correlation analyses between HLB value andfoaming, emulsifying properties

注：**在0.01水平上雙側(cè)顯著相關(guān)；*在0.05水平上雙側(cè)顯著相關(guān)

2.6　蔗糖硬脂酸酯的酶促合成

2.6.1產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

硅膠柱層析純化反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)1H-NMR,13C-NMR，ESI-MS鑒定，結(jié)果如下：

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5.29 (dd,J=8.0 Hz, 1H), 4.29 (m, 1H), 4.07 (dd,J=12.0, 5.4 Hz, 1H), 3.99 (m, 1H), 3.92 (ddd,J=10.1, 5.4, 2.0 Hz, 1H), 3.88 (t,J=7.9 Hz, 1H), 3.67 (m, 4H), 3.51 (q,J=12.3 Hz, 2H), 3.32 (dd,J=9.7, 3.8 Hz, 1H), 3.18 (t,J=3.7 Hz, 1H), 2.26 (m, 2H), 1.51 (d,J=6.9 Hz, 2H), 1.19 (s, 32H), 0.81 (d,J=6.7 Hz, 3H)

ESI-MS (m/z) 643.8 [ M+Cl ]-, 631.7 [ M+Na ]+

經(jīng)鑒定產(chǎn)物為蔗糖硬脂酸單酯。在此酶催化條件下，催化合成蔗糖硬脂酸單酯。

2.6.2酶促合成的蔗糖硬脂酸酯的HLB值測定

根據(jù)HLB值與水?dāng)?shù)的模擬參考方程，測定產(chǎn)物HLB值約為14.90，室溫條件下具有良好的水溶性，證明產(chǎn)物含有較多未被酯化的羥基，符合蔗糖硬脂酸單酯含有較多的親水性羥基的特點。

2.6.3蔗糖硬脂酸酯的起泡性能的測定

合成的蔗糖硬脂酸單酯在不同質(zhì)量濃度的起泡能力如圖4所示，合成的蔗糖硬脂酸酯起泡能力隨質(zhì)量濃度上升而呈上升趨勢，在1.00 g/L質(zhì)量濃度之后起泡能力基本不變，原因在于溶液達(dá)到臨界膠束濃度后，隨著部分泡沫破裂，起泡能力不再增加。泡沫穩(wěn)定性在質(zhì)量濃度為0.50 g/L之后出現(xiàn)下降趨勢，原因在于隨著質(zhì)量濃度的增加，氣液表面膜強(qiáng)度減小，泡沫容易破裂。

圖4　蔗糖硬脂酸酯的起泡能力及泡沫穩(wěn)定性與質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.4　The relationship between foamability, foamingstability and concentration of sucrose stearate

2.6.4蔗糖硬脂酸酯乳化性能的測定

合成的蔗糖硬脂酸酯屬于O/W型乳化劑，可以將不溶或溶解性較差的物質(zhì)分散于水相。不同質(zhì)量濃度的蔗糖硬脂酸酯的乳化能力和乳化穩(wěn)定性如圖5所示，合成的蔗糖硬脂酸酯的乳化能力隨著質(zhì)量濃度增加而增加，最高乳化能力達(dá)到72.32%，能夠降低油水界面的張力而形成均一體系，具有較好的分散能力；其乳化穩(wěn)定性最高為64.45%，可以使新形成的界面迅速被其單分子層所覆蓋，界面保持穩(wěn)定，形成均一、穩(wěn)定的乳化體系。

圖5　蔗糖硬脂酸酯的乳化能力及乳化穩(wěn)定性與質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.5　The relationship between emulsibility, emulsibilitystability and concentration of sucrose stearate

2.6.5商品化、酶促合成的蔗糖硬脂酸酯起泡性能、乳化性能的比較

如圖6所示，商品化和酶促合成的蔗糖硬脂酸酯的起泡能力無明顯差別，說明蔗糖硬脂酸酯起泡能力較低，可作為低泡乳化劑使用；而合成的蔗糖硬脂酸酯的泡沫穩(wěn)定性明顯低于商品化的蔗糖酯，可能由于前者組分單一，沒有二酯、多酯的協(xié)同作用，泡沫排列不夠緊密，排液速度增加，導(dǎo)致泡沫穩(wěn)定性下降；合成的蔗糖硬脂酸酯的乳化能力和乳化穩(wěn)定性略低于商品化蔗糖酯，但無明顯差別，說明二酯、多酯對于蔗糖硬脂酸酯的乳化性能存在協(xié)同作用，略優(yōu)于蔗糖硬脂酸單酯，但酶法合成蔗糖硬脂酸酯條件溫和，更為綠色安全，可以作為替代其化學(xué)法合成的途徑。

圖6　商品化、酶促合成的蔗糖硬脂酸酯起泡性能、乳化性能的比較Fig.6　The comparison of foaming and emulsifying propertiesbetween commercialization and synthesized by enzymatic

3　結(jié)論

本研究結(jié)果表明，蔗糖硬脂酸酯的HLB值隨單、二、多酯含量變化而變化，其中單酯含量與HLB值呈顯著相關(guān)，HLB值與起泡能力、泡沫穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性存在顯著相關(guān)關(guān)系，乳化能力隨HLB值減小呈先上升后下降的趨勢；本研究探索了在有機(jī)相混合體系中，加入相轉(zhuǎn)移催化劑十四烷基三甲基溴化銨，應(yīng)用Novozymes TLIM固定化脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸單酯。此反應(yīng)條件下合成的蔗糖硬脂酸單酯具有良好的水溶性，其HLB值為14.90，分別在1.00 g/L和2.00 g/L質(zhì)量濃度時具有較好的起泡能力和乳化作用。本文為蔗糖硬脂酸酯的實際應(yīng)用提供理論性指導(dǎo)以及對其酶法合成進(jìn)行了新的探索，具有重要的實踐應(yīng)用價值。

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