酵母源葡萄糖耐量因子GTF的純化及其鉻價(jià)態(tài)分析

許樂(lè)，李函彤，逄曉陽(yáng)，張書文，蘆晶，呂加平*，劉鷺*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京，100193)2(石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)(石家莊)有限公司，河北 石家莊，050031)

葡萄糖耐量因子(glucose tolernace factor, GTF)是由微量元素鉻、煙酸、甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸等成分組成的小分子蛋白復(fù)合物，具有水溶性，在A260有紫外吸收峰[11]，不被蛋白酶水解。GTF具有增強(qiáng)胰島素功能，促進(jìn)糖代謝和脂代謝，逆轉(zhuǎn)葡萄糖耐受不良，提高糖耐量；保護(hù)胰島素β細(xì)胞，提高胰島素受體數(shù)量及其親和力等功能[12-13]。機(jī)體GTF缺乏與Ⅱ型糖尿病的形成有較為密切的關(guān)系。我國(guó)18歲及以上居民糖尿病患病率約為9.7%。鉻缺乏是糖尿病的重要誘因之一。人體只能通過(guò)食物來(lái)攝取鉻。但食物精制加工、高糖飲食、衰老等生理應(yīng)激都會(huì)加劇組織中鉻的流失，造成現(xiàn)代人普遍性鉻缺乏。即使是營(yíng)養(yǎng)學(xué)家所設(shè)計(jì)的完全平衡化的營(yíng)養(yǎng)膳食也不能保證提供50 μg/d鉻的攝入量。所以，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑對(duì)特定人群進(jìn)行強(qiáng)化補(bǔ)鉻是一條有效途徑。目前，我國(guó)已將鉻(硫酸鉻、氯化鉻)作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑用于特殊膳食用食品的加工(GB14880—2012)。這2種鉻屬于無(wú)機(jī)鉻。相比于無(wú)機(jī)三價(jià)鉻的0.5%～2%吸收率，有機(jī)鉻的吸收率可達(dá)10%～25%，生物來(lái)源的GTF、低分子量鉻附合物(low-molecular-weight chromium-binding substance, LMWCr)吸收率和生物活性會(huì)更高。作為酵母代謝產(chǎn)物的GTF與動(dòng)物體內(nèi)鉻調(diào)素(chromodulin)一樣，同屬經(jīng)生物有機(jī)轉(zhuǎn)化的金屬蛋白，保守性和安全性較高，沒有降糖西藥的相關(guān)副作用，勢(shì)必成為糖尿病患者的重要保健食品。因此厘清GTF中鉻的價(jià)態(tài)對(duì)于未來(lái)GTF保健食品的開發(fā)以及酵母資源的深度加工有重要的意義。

酵母具有吸附金屬的能力。本研究中酵母通過(guò)生物吸附和生物轉(zhuǎn)化作用將環(huán)境中的無(wú)機(jī)鉻轉(zhuǎn)化為體內(nèi)鉻蛋白復(fù)合物質(zhì)——GTF。NEILE[14]等通過(guò)反相層析提取，體外脂肪細(xì)胞培養(yǎng)鑒定活性成分，采用31P核磁共振對(duì)3個(gè)分離組分進(jìn)行組成和結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)組分中含有多種有機(jī)磷酸鹽、無(wú)機(jī)磷酸鹽和聚磷酸鹽類物質(zhì)。王翀[15]利用紫外光譜和紅外光譜研究鉻在酵母細(xì)胞中的賦存形式。本研究在前期氨水提取基礎(chǔ)上，優(yōu)化有機(jī)溶劑提取條件，通過(guò)聯(lián)用溶劑提取及分子篩純化，得到純度相對(duì)較高的GTF樣品，旨在獲得用于鉻價(jià)態(tài)分析的GTF高純度樣品。由于酵母中GTF含量較少，提取過(guò)程步驟較多， GTF損失較高，因此本研究采用靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)HPLC-ICP-MS對(duì)純化后的GTF中的鉻價(jià)態(tài)進(jìn)行分析，以期為安全膳食鉻補(bǔ)充劑的篩選提供理論依據(jù)。HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)具有檢出限低、動(dòng)態(tài)線性范圍寬(0 ppb～1 000 ppm)、分析時(shí)間短、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[16-19]。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

啤酒酵母菌YSI-3.7，實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；三氯化鉻，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨水(分析純)，北京市化學(xué)試劑公司；SuperdexTM75、Sephadex G25，美國(guó)GE公司；Bio-WAX Column，日本安捷倫公司；鉻(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)液(1 000 μg/mL)，國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院；鉻(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)液(1 000 μg/mL)， 國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；鉻標(biāo)準(zhǔn)液(1 000 μg/mL)，中國(guó)計(jì)量科學(xué)院；乙二胺四乙酸(色譜純)，美國(guó)Sigma公司。

1.2　儀器與設(shè)備

1525型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；MB-102型恒溫金屬浴，日本BIOER公司；DRC-e型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)PerkinElmer公司；Bio-WAX色譜柱，美國(guó)Agilent公司；3K15冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司。

1.3　制備富鉻酵母菌粉

挑取在1 000 μg/mL的鉻濃度平板上長(zhǎng)出的YSI-3.7優(yōu)勢(shì)菌落，接種于鉻含量為500 μg/mL的培養(yǎng)液中發(fā)酵44 h，5 000 r/min離心10 min收集菌體，去離子水洗3次，冷凍干燥，制備凍干富鉻酵母菌粉。

1.4　氨水提取

將富鉻酵母菌粉與0.1 mol/L氨水以質(zhì)量體積比為1∶10(g∶mL)溶解[20-21]，經(jīng)37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)4 h，于10 000 r/min，4 ℃，離心30 min，收集上清液。參照1.9方法進(jìn)行消化及火焰原子吸收測(cè)定。

1.5　有機(jī)溶劑提取

1.5.1有機(jī)溶劑對(duì)GTF提取效果的影響

凍干富鉻酵母菌粉經(jīng)氨水提取，離心，收集上清液。取10 mL上清液數(shù)份，分別加入15 mL的甲醇、乙醇和丙酮，冰浴靜置30 min，10 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀。參照1.9方法進(jìn)行消化及火焰原子吸收，測(cè)定上清液、沉淀中的鉻含量；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液、沉淀部分的總蛋白。分別計(jì)算上清液和沉淀部分的總有機(jī)鉻量(μg)與總蛋白量(mg)的比值(即鉻蛋白比：每毫克蛋白中鉻的含量)，分析其提取效率。

1.5.2有機(jī)溶劑濃度對(duì)GTF提取效果的影響

取氨水提取后GTF的上清液(10 mL)，加入體積不同的乙醇，使乙醇最終體積分?jǐn)?shù)分別為60%、50%、40%、30%和15%，靜置提取，同時(shí)設(shè)置無(wú)乙醇提取組為空白對(duì)照，測(cè)定上清液中有機(jī)鉻和蛋白濃度，計(jì)算上清液中總有機(jī)鉻量、總蛋白以及鉻蛋白比(μg/mg)，確定乙醇最佳作用濃度。

1.5.3有機(jī)溶劑作用時(shí)間對(duì)GTF提取效果的影響

取氨水提取后GTF的上清液，加入30%乙醇沉淀，分別靜置15、20、30 min后，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液。參照1.9方法進(jìn)行消化及火焰原子吸收，測(cè)定上清液中有機(jī)鉻、蛋白濃度，計(jì)算上清液中總有機(jī)鉻量、總蛋白以及鉻蛋白比(μg/mg)，確定乙醇最佳作用時(shí)間。

1.6　SuperdexTM 75凝膠過(guò)濾層析

去離子水溶解GTF凍干菌粉，過(guò)0.22 μm膜，采用SuperdexTM75 (1.6 cm × 80 cm)凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行分離，以0.15 mol/L NaCl和50 mmol/L CH3COONH4混合(pH 6.0)為洗脫液，洗脫速度為0.3 mL/min，每管收集3 mL，各管洗脫液在A254吸收波處進(jìn)行蛋白吸光值的測(cè)定[22]，其有機(jī)鉻含量采用火焰原子吸收法測(cè)定[23-25]，繪制有機(jī)鉻、蛋白含量雙坐標(biāo)圖譜。收集鉻峰洗脫液，參照1.9方法進(jìn)行消化及火焰原子吸收測(cè)定。

1.7　Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析

將經(jīng)過(guò)SuperdexTM75凝膠過(guò)濾層析后的鉻峰洗脫液凍干粉用去離子水溶解，0.22 μm膜過(guò)濾，上Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析柱(1.0 cm×80 cm)，以去離子水為洗脫液，洗脫速度0.3 mL/min，各管洗脫液在A254吸收波處進(jìn)行蛋白吸光值的測(cè)定，其有機(jī)鉻含量采用火焰原子吸收法進(jìn)行測(cè)定，繪制有機(jī)鉻、蛋白含量雙坐標(biāo)圖譜，收集鉻峰處洗脫液，冷凍干燥備用。

1.8　有機(jī)鉻的提取

準(zhǔn)確稱取酵母菌粉0.1 g，溶于0.1 mol/L氨溶液中，在37 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，參照1.9方法進(jìn)行消化及火焰原子吸收測(cè)定。

1.9　樣品消化及鉻測(cè)定

將收集的上清液或沉淀置于溶樣杯中，加入6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68%的濃HNO3，160 ℃預(yù)加熱30 min，待溶液稍涼后，加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72%的HClO4和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的過(guò)硫酸銨溶液5 mL，于微波消解儀中進(jìn)行樣品消解，具體參數(shù)設(shè)置見表1。消解完畢后，加入1% NH4Cl溶液2.5 mL，其余用去離子水補(bǔ)齊至25 mL。參照 GB/T15555.6—1995方法，采用火焰原子吸收儀對(duì)樣品中的鉻量進(jìn)行測(cè)定。

表1　微波消解儀消化參數(shù)表Table 1　Parameters of microwave digestion instrument

1.10　GTF鉻價(jià)態(tài)分析

由于提取、純化酵母菌中的GTF的步驟較多，極易造成有機(jī)鉻的損失，且最終得到的純化物較少，本實(shí)驗(yàn)采用ICP-MS和HPLC聯(lián)用技術(shù)分析GTF 中的鉻價(jià)態(tài)。此方法具有接口簡(jiǎn)單、檢出限低、動(dòng)態(tài)線性范圍寬(0 ppb～1 000 ppm)、前處理簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。參照Agilent LC-ICP-MS技術(shù)手冊(cè)進(jìn)行鉻價(jià)態(tài)分析，方法略有改進(jìn)。

1.10.1高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜參數(shù)

高效液相色譜參數(shù)設(shè)置：

色譜柱采用Agilent Bio-WAX Column 5 μm，4.6 mm×50 mm(5190-2488)，室溫下運(yùn)行，進(jìn)樣量為30 μL。流動(dòng)相為0.075 mol/L NH4NO3，流速為0.6 mL/min。

電感耦合等離子體質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：

采用玻璃同心霧化器，RF功率1 550 W，采樣深度8 mm，載氣1.2 L/min，積分時(shí)間0.8 s，52Cr，以氦氣模式4.5 mL/min，蠕動(dòng)泵0.3 r/s。

1.10.2標(biāo)準(zhǔn)試劑的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

緩沖液：0.075 mol/L HNO3和0.6 mmol/L EDTA，氨水調(diào)pH為7.0。

流動(dòng)相：0.075 mol/L HNO3，氨水調(diào)pH至7.0。

鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.5 g Cr(Ⅲ)和0.5 g Cr(Ⅵ)溶液，緩沖液稀釋至50 g，制成鉻混合液M1，之后用流動(dòng)相將M1配置成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)系列使用液，調(diào)pH為7.0，50 ℃水浴加熱1 h，參照1.10.1的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行測(cè)定與分析(圖1)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

圖1　Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ) 混合標(biāo)準(zhǔn)液HPLC-ICP-MS色譜圖Fig.1　Total ion flow diagram of standard chromium solutionof trivalent chromium and hexavalent chromium

圖2　鉻標(biāo)準(zhǔn)液中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Chromium standard solution in peak area of standardcurve of trivalent chromium and hexavalent chromium

1.10.3GTF樣品處理

將Sephadex G25層析后收集得到的鉻峰洗脫液凍干成粉后，取0.1 g左右樣品，用3 mL 0.07 mol/L HCl溶解，37℃水浴振蕩1 h，37 ℃靜置1 h，用0.22 μm過(guò)濾膜過(guò)濾，8 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液加入1 mL 0.07 mol/L NH3·H2O和8 mL緩沖液，于50 ℃保溫加熱1 h，使緩沖液中的EDTA和GTF 中的Cr(Ⅲ)絡(luò)和形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。取30 μL參照1.10.1的參數(shù)設(shè)置進(jìn)行HPLC-ICP-MS 的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)分析。

1.11　數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1　氨水聯(lián)用有機(jī)溶劑提取GTF

2.1.1有機(jī)溶劑的種類對(duì)GTF提取效果的影響

文獻(xiàn)表明GTF可溶解于氨水、乙醇等有機(jī)溶劑[26-27]。同時(shí)在蛋白分離純化過(guò)程中，有機(jī)溶劑還具有沉淀蛋白的功能。因此本實(shí)驗(yàn)在氨水提取的基礎(chǔ)上，選擇甲醇、乙醇和丙酮3種常見的有機(jī)溶劑繼續(xù)提取GTF，分析上清液和沉淀中的鉻絕對(duì)值和鉻蛋白比，結(jié)果如圖3、表2所示。甲醇提取后，上清液中有機(jī)鉻量為61 μg，沉淀物中有機(jī)鉻量為33 μg；乙醇提取后，其上清液和沉淀物中的有機(jī)鉻量分別為85 μg和21 μg，上清液中鉻量是沉淀物中鉻量的4倍多；丙酮提取后，其上清液和沉淀中有機(jī)鉻量分別為62 μg和23 μg，上清液中鉻量也將近是沉淀物總量的3倍。表2顯示了不同提取組分中的鉻蛋白比。鉻蛋白比指每毫克蛋白中的鉻含量，在一定程度上可用于衡量GTF提取純化的效果。其比值越高，表示雜蛋白越少，物質(zhì)越純。相較于氨水提取組(對(duì)照組)，經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑提取后，GTF中鉻蛋白比值都有所提高。其中乙醇提取的上清液中，鉻蛋白比為2.4。相比于氨水提取法的鉻蛋白比0.818，提高將近3倍。

圖3　不同有機(jī)溶劑提取對(duì)提取液中有機(jī)鉻含量及蛋白含量的影響Fig.3　Effect of organic solvent on exaction of organicchromium content and protein content

2.1.2有機(jī)溶劑濃度對(duì)GTF提取效果的影響

為確定乙醇最佳作用濃度，本實(shí)驗(yàn)選取60%、50%、40%、30%、15%這5個(gè)不同濃度的乙醇提取GTF，于0 ℃冰浴靜置20 min,結(jié)果由圖4所示。

表2　不同有機(jī)溶劑對(duì)提取液中鉻蛋白比的影響　單位：μg/mg

圖4　不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)GTF提取液中有機(jī)鉻含量及蛋白含量的影響Fig.4　Effect of various ethanol concentration on exactionof organic chromium and protein content

由圖可知，其鉻蛋白的比值分別為1.077、0.812、0.59、5.015和1.412，對(duì)照組鉻蛋白比為0.804。乙醇的靜置處理有助于GTF的進(jìn)一步提取。提取倍數(shù)分別為對(duì)照組的1.34、1.01、6.24、1.76倍。其中30%的乙醇濃度靜置處理，GTF的純度顯著提高。因此最終選擇30%乙醇進(jìn)行GTF的提取。鉻蛋白比相較于對(duì)照組提高了6倍。

2.1.3有機(jī)溶劑靜置時(shí)間對(duì)GTF提取效果的影響

為確定乙醇最佳靜置時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)選取15、20、30、50 min作用4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，結(jié)果如圖5所示。隨靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，上清液中鉻的含量和蛋白的含量逐漸增加。靜置20 min時(shí)，其總鉻含量最高，為133.492 μg，鉻蛋白比達(dá)到5.015；靜置30 min時(shí)，總鉻含量為120.05μg，上清液中溶解蛋白較大，為56.902 mg。總體來(lái)看，隨著靜置時(shí)間增長(zhǎng)，蛋白溶解增加，鉻蛋白比降低。因此綜合考慮鉻蛋白比及時(shí)間，選擇靜置處理20 min，收集上清液。

圖5　靜置時(shí)間對(duì)GTF提取液中有機(jī)鉻含量及蛋白含量的影響Fig.5　Effect of various precipitation time on the extractionof organic chromium and protein content

2.2　凝膠層析聯(lián)用純化GTF

2.2.1SuperdexTM75分子篩層析

有研究報(bào)道[28-29]，GTF是分子質(zhì)量為750～1 500 Da的小分子蛋白肽?；诖?，選擇SuperdexTM75進(jìn)行粗提液純化，去除GTF中的大分子蛋白。結(jié)果如圖6所示。GTF粗提液經(jīng)SuperdexTM75 層析，得到4個(gè)蛋白峰。其中前2個(gè)蛋白峰含鉻。蛋白峰2的鉻的含量明顯高于蛋白峰1。分子篩層析是依據(jù)蛋白分子質(zhì)量不同而進(jìn)行分離。大分子物質(zhì)首先被洗脫。而GTF為為小分子物質(zhì)，可知第2個(gè)鉻峰為目的峰。收集目的峰洗脫液，真空濃縮。

圖6　SuperdexTM 75凝膠過(guò)濾層析圖譜Fig.6　SuperdexTM 75 gel filtration chromatography

2.2.2Sephadex G25分子篩層析

收集SuperdexTM75的鉻峰，選擇分離范圍為1 000～5 000 Da的Sephadex G25進(jìn)一步分離純化。 Sephadex G25是經(jīng)典的葡聚糖和環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián)介質(zhì)，擁有極高的選擇性和分辨率，可對(duì)較小分子質(zhì)量的蛋白有很好的分離效果。結(jié)果如圖7所示。經(jīng)過(guò)凝膠層析分離得到A254蛋白峰1個(gè)，鉻峰與蛋白峰重合。由此可以得到，富鉻酵母粉經(jīng)氨水和低溫低濃度乙醇提取，再經(jīng)SuperdexTM75和Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析，可以去除大量雜蛋白，得到GTF。收集鉻峰、凍干，進(jìn)行鉻的形態(tài)分析。

圖7　Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析圖譜Fig.7　Sephadex G25 gel filtration chromatography

2.3　GTF鉻價(jià)態(tài)分析

Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)混合標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖(圖1)顯示Cr(Ⅲ)出峰范圍在第33～97 s；Cr(Ⅵ)在145～209 s時(shí)出峰。分別對(duì)這2個(gè)鉻峰進(jìn)行面積積分，繪制Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的標(biāo)曲(圖2)。對(duì)鉻峰進(jìn)行面積積分，得到Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)峰面積線性方程分別為：

Cr(Ⅲ):y=20 662 800x-6 518 060

(1)

Cr(Ⅵ):y=6 745 060x+23 662 200

(2)

式中：x為洗脫時(shí)間，y為總離子峰面積。根據(jù)此方程式可以計(jì)算樣品中的鉻質(zhì)量濃度。

如圖8所示，經(jīng)過(guò)提取純化的GTF中有且只有1個(gè)鉻峰，于31 s出峰，90 s左右洗脫完全，出峰范圍在Cr(Ⅲ)范圍內(nèi)，由此可見，GTF中存在Cr(Ⅲ)，不存在Cr(Ⅵ)。同時(shí)，根據(jù)Cr(Ⅲ)鉻峰面積線性方程，該樣品的鉻離子濃度為6.21 μg/mL，這與火焰原子吸收測(cè)得其有機(jī)鉻的含量相同，證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。但從圖8中也可看出，在67.227 s時(shí)有1個(gè)小峰出現(xiàn)，這個(gè)小峰與Cr(Ⅲ)的峰極為接近。同時(shí)與標(biāo)液的HPLC-ICP-MS色譜圖(圖1)相比，該小峰也不屬于六價(jià)鉻的峰。因此猜測(cè)可能是由于樣品中一部分Cr(Ⅲ)與EDTA絡(luò)和結(jié)構(gòu)脫離，形成不穩(wěn)定狀態(tài)所以造成圖中拖尾現(xiàn)象的發(fā)生。

圖8　GTF純化樣品HPLC-ICP-MS色譜圖Fig.8　HPLC-ICP-MS chromatogram of GTF

3　結(jié)論

鉻(Ⅲ)是人體的基本營(yíng)養(yǎng)元素之一，主要是通過(guò)激活體內(nèi)鉻調(diào)素(chromodulin)來(lái)協(xié)同或增強(qiáng)胰島素功能而發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)糖、脂類等正常代謝。中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量表規(guī)定三價(jià)鉻的適宜攝入量[AIs(μg)]攝入量為50 μg/d(18～50歲人群)。由于富鉻酵母中GTF的鉻價(jià)態(tài)不清，限制了富鉻酵母的深度開發(fā)及其膳食鉻補(bǔ)充劑的開發(fā)[30]。

富鉻酵母粉經(jīng)氨水聯(lián)用乙醇提取，靜置20 min，其粗提液的總有機(jī)鉻量為133.5 μg。相比于氨水提取，鉻蛋白比提高了6倍。該粗提液經(jīng)兩級(jí)分子篩凝膠層析柱分離，得到1個(gè)與鉻峰重合的蛋白峰，二者重合性較好。將此分離純化得到的GTF通過(guò)HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行鉻價(jià)態(tài)分析。結(jié)果顯示鉻出峰的時(shí)間為31 ～90 s，該出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中三價(jià)鉻的出峰時(shí)間一致。本研究結(jié)果表明，GTF中的鉻是以Cr(Ⅲ)形態(tài)存在，無(wú)Cr(Ⅵ)存在，為GTF保健食品或膳食鉻補(bǔ)充劑的安全開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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