高效凝膠色譜法同時(shí)測(cè)定普魯蘭多糖生物合成過(guò)程中分子量和含量

安超，薛文嬌，馬賽箭，丁浩

（陜西省微生物研究所，陜西西安710043）

普魯蘭多糖是由出芽短梗霉（Aureobacidium pullulans）發(fā)酵產(chǎn)生的細(xì)胞外純天然高分子多糖，是一種新型可降解生物材料。該多糖是以α-1，6-糖苷鍵連接的聚麥芽三糖，一般沒(méi)有分支結(jié)構(gòu)，是直鏈多糖，具有良好的生物相容性。近年來(lái)，普魯蘭多糖在藥物載體、藥物控釋、生物材料（如水凝膠、人工骨）等方面被廣泛研究及應(yīng)用。這些領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)將直接提升普魯蘭多糖的價(jià)值，但同時(shí)也對(duì)普魯蘭多糖分子量大小和分布提出了更高的要求。商品化的普魯蘭多糖重均分子量只有兩種規(guī)格，分別為200 kDa和300 kDa，這在很大程度上限制了普魯蘭多糖在生物醫(yī)藥中應(yīng)用。

普魯蘭多糖分子量的范圍在1.5×104Da～1.0×107Da之間，其主要受生產(chǎn)菌種和發(fā)酵條件影響[1]。研究發(fā)現(xiàn)，普魯蘭多糖發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵周期是影響普魯蘭多糖分子量大小的主要因素[2-4]，特別是在發(fā)酵過(guò)程中，普魯蘭多糖分子量是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化。一般而言，聚合物分子量的測(cè)定可以通過(guò)黏度法、小角激光光散射法和凝膠色譜法[5-6]。在出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的過(guò)程中，傳統(tǒng)的普魯蘭多糖分子量和含量檢測(cè)方法需要首先獲得普魯蘭多糖干燥固體，進(jìn)而通過(guò)稱重法和高效凝膠色譜法分別測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中普魯蘭多糖產(chǎn)量和分子量[7]，其中，干燥的過(guò)程需要1天時(shí)間，這種方法不能實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程中普魯蘭多糖的分子量和含量。為了實(shí)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中同步檢測(cè)普魯蘭多糖的含量和分子量大小，在本研究中，通過(guò)建立一種快速的檢測(cè)方法，直接利用發(fā)酵液通過(guò)高效凝膠色譜法同時(shí)檢測(cè)出芽短梗霉發(fā)酵液中普魯蘭多糖的含量和分子量大小，這為精準(zhǔn)控制普魯蘭多糖發(fā)酵過(guò)程中普魯蘭多糖分子量及含量提供可靠技術(shù)手段。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1　菌株

低色素分泌的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）CGMCC No.11602，由陜西省微生物研究所代謝產(chǎn)物研究中心選育獲得，目前，以專利菌株形式保藏于中國(guó)普通微生物保藏中心。

1.1.2　培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 50 g，酵母粉 2.5 g，（NH4）2SO40.6 g，NaCl 1.0 g，K2HPO45.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水 1 L，初始 pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖50 g，酵母粉2.5 g，（NH4）2SO40.6 g，NaCl 1.0 g，K2HPO45.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水 1 L，初始 pH 6.5。

1.1.3　標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

不同分子量普魯蘭多糖的標(biāo)準(zhǔn)物：Sigma公司，具體如表1所示。

表1　不同分子量普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品Table 1　The pullulan standard with different molecular weight

1.1.4　試劑

無(wú)水乙醇（分析純）：天津天力化學(xué)試劑有限公司，硝酸鈉（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2　儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱SPX-250：北京科偉永興儀器有限公司；恒溫?fù)u床ZWY-2102：上海智城分析儀器制造有限公司；冷凍離心機(jī) 5804R：Eppendorf co.，LTD；萬(wàn)分之一天平 BSA 2245（Sartorius co.，LTD），4×5L 發(fā)酵罐：上海寶興生物儀器有限責(zé)任公司；高效凝膠色譜儀1515-2424、保護(hù)柱（UltrahyfrogelTM6×40 mm）和凝膠柱（UltrahydrogelTMLinear 7.8×300 mm）：Waters Chromatography，Inc。

1.3　方法

1.3.1　普魯蘭多糖發(fā)酵

平板活化：將4℃斜面保藏的出芽短梗霉SWP35接種于PDA平板上，28℃培養(yǎng)5 d。

種子培養(yǎng)：將活化好的菌種接種于種子培養(yǎng)液，28℃，1 230 r/min搖床培養(yǎng)2 d。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：按照5%的接種量，將培養(yǎng)好的種子液接種于裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)液的5 L玻璃發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速400 r/min，通氣量1vvm，尾壓0.05 Mpa。

1.3.2　普魯蘭多糖產(chǎn)量及分子量測(cè)定

在發(fā)酵過(guò)程中，每24h取樣一次，每次取樣30mL，裝入50mL離心管中，通過(guò)轉(zhuǎn)速10000r/min，離心6min去除菌體，然后取上清液15 mL加入30 mL預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀，4℃維持12 h，最后通過(guò)轉(zhuǎn)速8 000r/min，離心6 min，獲得酒精沉淀物，最后通過(guò)80℃烘干，通過(guò)稱重法計(jì)算發(fā)酵液中普魯蘭多糖含量[8]。

式中：Mg為總重，g；Me為離心管空重，g。

根據(jù)傳統(tǒng)的分子量測(cè)定方法，通過(guò)烘干獲得的粗多糖被研磨成粉，并且用水配制成1mg/mL的溶液，然后通過(guò)高效凝膠色譜法進(jìn)行測(cè)定。在本研究中，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液上清液進(jìn)行合理稀釋，然后通過(guò)高效凝膠色譜法同時(shí)測(cè)定普魯蘭多糖的含量和分子量。

1.3.3　高效凝膠色譜測(cè)定普魯蘭多糖的方法

流動(dòng)相 0.1 mol/L NaNO3，流速 0.5 mL/min，柱溫30℃，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)（Waters 2424），進(jìn)樣量20 μL，所有的測(cè)試結(jié)果通過(guò)Breeze軟件（Waters Chromatography，Inc）積分處理[9]。

1.3.4　普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]，使用6個(gè)1mg/mL水溶液的普魯蘭多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)品（Mw范圍：9600Da～2350000Da），依據(jù)上述測(cè)試方法進(jìn)行分子量的測(cè)定，通過(guò)儀器自帶的Breeze軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。普魯蘭多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線則采用3個(gè)已知分子量（Mp：6 100 Da，47 100 Da，642 000 Da），且已知濃度（0.2mg/mL～1.0mg/mL）的普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)對(duì)其峰面積積分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

1.3.5　準(zhǔn)確性和重復(fù)性

準(zhǔn)確性：根據(jù)上述測(cè)試方法，分別對(duì)已知濃度、已知分子量的兩個(gè)不同分子量普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液進(jìn)行6次測(cè)試。錯(cuò)誤率被用來(lái)描述實(shí)際測(cè)試樣品的分子量（Mwo）與原始樣品的分子量（Mw）之間的誤差關(guān)系，具體計(jì)算方法為：

回收率被用來(lái)評(píng)估方法的準(zhǔn)確性，通過(guò)比較測(cè)試樣品含量（Co）和原始樣品含量（Cn）之間的比值來(lái)計(jì)算。具體的計(jì)算方法如下：

重復(fù)性：通過(guò)對(duì)兩組普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行6個(gè)平行樣本的測(cè)試數(shù)據(jù)，計(jì)算出RSD%（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）。

1.3.6　分析方法

所有的檢測(cè)都設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)通過(guò)Origin Pro 8（OriginLab Corporation，Northampton，USA）軟件進(jìn)行方差分析，使用Tukey法進(jìn)行不同樣本在95%置信水平平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較。

2　結(jié)果與討論

2.1　普魯蘭多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

根據(jù)分子量大小差異，6個(gè)不同分子量普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品被分為2組，配制成混合水溶液進(jìn)行高效凝膠色譜檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1　6個(gè)普魯蘭多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)品的高效凝膠色譜圖Fig.1　The high gel chromatography of six pullulan polysaccharides molecular weight standard

由圖1可以看出，每組混合樣品中，不同分子量普魯蘭多糖都能得到較好分離。按照Waters自帶的Breeze軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，如圖2所示，結(jié)果表明：普魯蘭多糖流出體積（mL）與log Mp線性關(guān)系很好，相關(guān)系數(shù)R2為99.83%。6個(gè)樣本積分計(jì)算結(jié)果如表2所示。

圖2　普魯蘭多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　The standard curve of pullulan molecular weight

表2　6個(gè)普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品積分計(jì)算Table 2　The results of six samples integral calculation

結(jié)果表明：當(dāng)不同分子量的普魯蘭多糖具有相同濃度時(shí)，積分面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.79%。因此，可以推斷峰面積只與普魯蘭多糖濃度有關(guān)，可能不受分子量的影響。

2.2　普魯蘭多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

5個(gè)不同濃度的普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的色譜分離結(jié)果如圖3所示。

圖3　凝膠色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定Fig.3　The standard curve of the gel permeation chromatogram

由圖3可以看出，峰面積大小與普魯蘭多糖含量存在一定的線性關(guān)系，通過(guò)Breeze軟件積分，結(jié)果如表3所示。

在0.2mg/mL～1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)，在同一濃度的條件下，普魯蘭多糖峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%的范圍為0.64%～0.95%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1%，重復(fù)性好。將峰面積與含量進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖4所示。

表3　峰面積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果從五濃度的pullulan標(biāo)準(zhǔn)Table 3　The statistical results of peak area from five concentrations of the pullulan standards

圖4　普魯蘭多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　The standard curve between peak areas and concentrations of pullulan

由圖4可以看出：峰面積與普魯蘭多糖含量之間符合正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.997 5。

2.3　穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性的評(píng)估

使用2個(gè)已知濃度的普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行方法穩(wěn)定性和回收率試驗(yàn)，按照上述試驗(yàn)步驟進(jìn)行處理，平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%），測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可以看出，通過(guò)該方法，2個(gè)樣品分子量測(cè)試中，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）分別為0.14%和0.13%，誤差率分別為0.04%和0.02%；而在含量的測(cè)試中，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）分別為0.02%和0.01%，產(chǎn)品回收率分別達(dá)到99.7%和99.6%。

2.4　出芽短梗霉CGMCC No.11602發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖過(guò)程中含量及分子量?jī)煞N測(cè)定比較

為了驗(yàn)證新方法的可靠性，在本文中，同時(shí)采用了新方法和傳統(tǒng)方法，在出芽短梗霉CGMCC No.11602發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖同時(shí)測(cè)定普魯蘭多糖含量和分子量。單因素方法分析被用來(lái)評(píng)價(jià)新方法和傳統(tǒng)方法測(cè)試結(jié)果的顯著性，結(jié)果如表5所示。

表4　目標(biāo)物分子量和含量測(cè)試過(guò)程中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率Table 4　The relative standard deviation and recovery rate of molecular weight and content

表5　出芽短梗霉CGMCC No.11602發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖過(guò)程中發(fā)酵液中普魯蘭多糖含量及分子量Table 5　The pullulan content and molecular weight during the fermentation process of A.pullulans CGMCC No.11602

由表5可知：在發(fā)酵過(guò)程中4次測(cè)試中，新方法與傳統(tǒng)方法測(cè)試分子量的數(shù)據(jù)之間p值在0.143～0.334之間；新方法與傳統(tǒng)方法測(cè)試含量的數(shù)據(jù)之間p值在0.143～0.946之間，p值均大于0.05。因此，新方法和傳統(tǒng)方法測(cè)定結(jié)果之間無(wú)顯著性差異。

3　結(jié)論

普魯蘭多糖具有良好的生物相容性，具有特殊的聚合方式和線性連接結(jié)構(gòu)。近年來(lái)，普魯蘭多糖在生物材料和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用，大大提高了普魯蘭多糖的附加值，但也對(duì)普魯蘭多糖的特性提出了更高的要求，特別是分子量和分子量分布。從理論上講，獲得不同分子量微生物多糖的方法包括有機(jī)溶劑沉淀分級(jí)、超濾、納米過(guò)濾、凝膠層析過(guò)濾級(jí)發(fā)酵調(diào)控等手段。

在發(fā)酵過(guò)程中，特別是后期發(fā)酵過(guò)程中，普魯蘭多糖的含量和分子量是不斷變化的。本文采用保護(hù)柱（UltrahyfrogelTM6×40 mm） 和凝膠柱（UltrahydrogelTMLinear 7.8×300 mm，Waters Chromatography，Inc），流動(dòng)相 0.1mol/L NaNO3，流速 0.5 mL/min，柱溫 30 ℃，示差折光檢測(cè)器（Waters 2424），利用分子量在9.6 kDa～2 350 kDa范圍內(nèi)普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，普魯蘭多糖流出體積（mL）與log Mp線性關(guān)系很好，相關(guān)系數(shù)R2為99.83%，在發(fā)酵過(guò)程中，將取樣離心去除菌體獲得的發(fā)酵液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的方法進(jìn)行分子量測(cè)定，并與傳統(tǒng)的普魯蘭多糖分子量測(cè)定方法相比較（先獲得普魯蘭多糖粗品，然后再測(cè)定獲得分子量），新方法與傳統(tǒng)方法測(cè)試分子量的數(shù)據(jù)之間p值在0.143～0.334之間，新方法與傳統(tǒng)方法測(cè)試含量的數(shù)據(jù)之間p值在0.143～0.946之間，p值均大于0.05。因此，新方法和傳統(tǒng)方法測(cè)定結(jié)果之間無(wú)顯著性差異。

新方法幾乎實(shí)現(xiàn)了同步檢測(cè)發(fā)酵液中普魯蘭多糖的含量和分子量（檢測(cè)時(shí)間＜1 h），與此同時(shí)，該方法具有較好的準(zhǔn)確性、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。因此，本研究可以通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程，指導(dǎo)規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)不同分子量的普魯蘭多糖，降低生產(chǎn)成本，拓展了普魯蘭多糖的應(yīng)用范圍。

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