銀白色葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法的建立

郭正洋,劉鐘棟,王遠(yuǎn)洋,陳 晶,陳國(guó)培,蘭全學(xué),劉小青,*

(1.河南工業(yè)大學(xué),河南鄭州 450001;2.深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院,廣東深圳 518131)

銀白色葡萄球菌(Staphylococcusargenteus)作為一種新型葡萄球菌,與金黃色葡萄球菌極其相似[1]。早在2002年在澳大利亞就有相關(guān)報(bào)道[2],由于銀白色葡萄球菌缺少合成類胡蘿卜素的基因,在培養(yǎng)基上菌落形態(tài)呈現(xiàn)銀白色,與部分金黃色葡萄球菌的形態(tài)一致[3],通過(guò)API生化鑒定系統(tǒng)和vitic2的鑒定方法,也達(dá)不到區(qū)分金黃色葡萄球菌和銀白色葡萄球菌的目的[4]。目前有關(guān)銀白色葡萄球菌感染的報(bào)道有限,但針對(duì)銀白色葡萄球菌的致病性先后在柬埔寨[5]、尼日利亞[6]、法國(guó)[7]、斐濟(jì)[8]、泰國(guó)[9]和多巴哥共和國(guó)[10]等國(guó)都有相關(guān)描述,在我們國(guó)家也有發(fā)現(xiàn)銀白色葡萄球菌的存在[11]。有研究者認(rèn)為銀白色葡萄球菌與金黃色葡萄球菌會(huì)以同樣的方式威脅人體健康[12],在泰國(guó)侵襲性葡萄球菌引起的敗血癥,其中五分之一是有銀白色葡萄球菌導(dǎo)致的[1314];在澳大利亞的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),銀白色葡萄球菌會(huì)導(dǎo)致皮膚感染和軟骨癥[1]。因此,加強(qiáng)對(duì)該菌的認(rèn)識(shí)了解,提高對(duì)它的重視,加強(qiáng)對(duì)它的監(jiān)測(cè)管理已刻不容緩。

Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)從眾多檢測(cè)技術(shù)中脫穎而出,它不僅具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)點(diǎn),而且與普通PCR方法相比,由于引物和探針的“雙保險(xiǎn)”,因此特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高,并實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)在線檢測(cè),同時(shí)適用范圍廣泛,目前已經(jīng)成為一種常用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)[15]。而非核糖體多肽合成酶基因(NRPS)在金黃色葡萄球菌和銀白色葡萄球菌中都有存在,但在兩種菌種之間該基因一段序列存在明顯差異,這就有利于開(kāi)發(fā)分子學(xué)方法進(jìn)行區(qū)別驗(yàn)證。本文根據(jù)NRPS基因設(shè)計(jì)引物探針,建立一種Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR的方法快速檢測(cè)銀白色葡萄球菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)準(zhǔn)菌株 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司代為購(gòu)買(mǎi)(表1);Premix預(yù)混合液RR390A(TAKALA) 由廣州環(huán)凱微生物科技有限公司;引物和探針 均由上海生物工程股份有限公司合成;所用培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;血瓊脂平板 鄭州安圖生物工程股份有限公司。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株Table 1 Experimental strains

330K冷凍離心機(jī) Sigma公司;ND1000分光光度計(jì) Gene Company Limited;實(shí)時(shí)熒光PCR儀MX3005P 美國(guó)安捷倫公司;金屬干浴器D1100 Labnet International公司;凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀 BioRad公司;恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物及探針 根據(jù)NCBI上已經(jīng)公布的銀白色葡萄球菌的非核糖體多肽合成酶基因,選擇特異性序列設(shè)計(jì)引物和探針。探針5′末端用FAM修飾,3′末端利用猝滅基團(tuán)C3spacer標(biāo)記,并由上海生物工程有限公司合成其序列見(jiàn)表2。

表2 銀白色葡萄球菌NRPS基因引物及Taqman探針序列Table 2 The primers and probe of Staphylococcus argenteus NRPS

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 將本研究中所用的菌株分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中,放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,振蕩時(shí)的溫度為35 ℃,振幅160 RPM,過(guò)夜培養(yǎng),吸取1 mL培養(yǎng)菌液滴加到1.5 mL離心管內(nèi),在4 ℃條件下12000 r/min離心2 min,棄去上清液,加入500 μL無(wú)菌生理鹽水,充分振蕩混勻,在4 ℃條件下12000 r/min離心1 min,棄上清,重復(fù)添加無(wú)菌生理鹽水,再離心,棄上清。添加50 μL生理鹽水,100 ℃水浴10～15 min,待冷卻至室溫,之后在4 ℃條件下12000 r/min離心1 min,上清液于20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立 根據(jù) Premix Ex Taq TM(Probe q PCR)Kit試劑盒推薦的各組分濃度和循環(huán)參數(shù),初步建立Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系,其中Premix taq(Ex Taq Version 2.0)12.5 μL,上游引物和下游引物各1 μL,探針為0.5 μL,去離子水為8 μL,最后添加2 μL待測(cè)模板。并根據(jù)引物、探針的退火溫度,調(diào)整優(yōu)化退火溫度,根據(jù)Ct值確定較為合適的退火溫度。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR特異性實(shí)驗(yàn) 以銀白色葡萄球菌(DAM 28299)作為陽(yáng)性對(duì)照,無(wú)菌生理鹽水作為空白對(duì)照,分別對(duì)金黃色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,白色葡萄球菌,木糖葡萄球菌,假中間葡萄球菌,頭狀葡萄球菌,山羊葡萄球菌,以及單核細(xì)胞增生李斯特菌,阪岐腸桿菌,志賀氏菌,沙門(mén)氏菌,副溶血性弧菌,大腸O157等進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度實(shí)驗(yàn) 將水煮法提取的編號(hào)為DSM 28299的銀白色葡萄球菌的DNA模板,等梯度稀釋至10-5,6個(gè)梯度,其DNA模板的濃度為111.7、11.2、1.1、0.1 ng/μL、10、1 pg/μL,無(wú)菌生理鹽水作為空白對(duì)照,對(duì)該方法的靈敏度進(jìn)行分析。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)室分離菌株的鑒定 利用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)傳統(tǒng)分離方法得到的金黃色葡萄球菌,其中以DSM 28299的銀白色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照,無(wú)菌生理鹽水為空白對(duì)照。

1.2.7 普通PCR檢測(cè)方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Daofeng Zhang等[12]建立普通PCR方法,對(duì)銀白色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株,以及本方法從實(shí)驗(yàn)室分離株中確定為銀白色葡萄球菌的菌株進(jìn)行鑒定驗(yàn)證,序列如表3所示。

表3 常規(guī)PCR鑒定銀白色葡萄球菌的引物Table 3 Conventional PCR primers for the identification of Staphylococcus argenteus

1.2.8 人工模擬污染實(shí)驗(yàn) 取25 g經(jīng)傳統(tǒng)檢測(cè)方法未檢出銀白色葡萄球菌的新鮮奧爾良雞肉樣品,加入225 mL 7.5%的生理鹽水,制成勻漿;從上述勻漿中吸取0.5 mL于裝有的營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中,并再加入0.5 mL濃度為5×108cfu/mL DSM28299 的銀白色葡萄球菌,充分混勻;放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,振蕩時(shí)的溫度為35 ℃,振幅160 r/min,過(guò)夜培養(yǎng),參照1.2.2中提取DNA的方法,將提取的DNA等梯度稀釋至10-5,6個(gè)梯度,其DNA模板的濃度為101.4、10.2、1.0、0.1、0.01、0.001 ng/μL,然后進(jìn)行模擬污染的靈敏度實(shí)驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立

根據(jù)引物及探針的退火溫度,在擴(kuò)增時(shí)設(shè)計(jì)不同的退火溫度,提高該方法的特異性。本實(shí)驗(yàn)以編號(hào)為DSM 28299的銀白色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照,去離子水作為空白對(duì)照,通過(guò)在不同退火溫度條件下(55、58、60 ℃)進(jìn)行擴(kuò)增,熒光PCR的循環(huán)條件為預(yù)變性95 ℃ 3 min;變性94 ℃ 5 s,退火延伸55 ℃/58 ℃/60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖1(退火溫度為58 ℃)所示,無(wú)論從擴(kuò)增效率還是Ct值來(lái)分析,當(dāng)退火溫度為58 ℃時(shí)更符合我們的要求。

圖1 銀白色葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立Fig.1 The establishment of a realtime PCR method for Staphylococcus argenteus注:1表示編號(hào)為DSM 28299銀白色葡萄球菌的擴(kuò)增曲線;2表示空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR特異性分析

1.2.4中各種菌的擴(kuò)增結(jié)果如圖2和圖3所示,本實(shí)驗(yàn)所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法可以檢測(cè)出編號(hào)為DSM 28299和SITUF 20420的銀白色葡萄球菌,同屬不同種以及常見(jiàn)的致病菌的擴(kuò)增曲線與空白的擴(kuò)增曲線呈陰性,從而說(shuō)明我們所建立的PCR方法的特異性良好,能夠有效的將銀白色葡萄球菌從其他菌中區(qū)分鑒定出來(lái)。

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性實(shí)驗(yàn)1Fig.2 Detection specificity 1 of Staphylococcus argenteus by RTPCR注:1為DSM28299銀白色葡萄球菌;2為SITUF銀白色葡萄球菌;3～8為陰性對(duì)照,分別為單增李斯特菌、阪岐腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌;9為空白對(duì)照。

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性實(shí)驗(yàn)2Fig.3 Detection specificity 2 of Staphylococcus argenteus by RTPCR注:1為DSM28299銀白色葡萄球菌;2為SITUF銀白色葡萄球菌;3～9為陰性對(duì)照,分別為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、假中間葡萄球菌、山羊葡萄球菌、木糖葡萄球菌;10為空白對(duì)照。

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度分析

利用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法分別對(duì)不同梯度的模板進(jìn)行檢測(cè)(見(jiàn)圖4),結(jié)果表明,當(dāng)DNA模板濃度為0.01 ng/μL,結(jié)果呈現(xiàn)規(guī)則的,典型的擴(kuò)增曲線;而當(dāng)模板濃度為0.001 ng/μL時(shí),也就是1 pg/μL,雖然擴(kuò)增曲線與空白之間存在差異,但其Ct值偏大,影響結(jié)果的判定。從而說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)銀白色葡萄球菌的靈敏度為0.01 ng/μL。

圖4 實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)Fig.4 Detection sensitivity of Staphylococcus argenteus by RTPCR注:1～7分別代表DNA模板的濃度為111.7、11.2、1.1、0.1、0.01、0.001 ng/μL以及空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果。

2.4 分離菌株的檢測(cè)

采用建立的熒光PCR方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)傳統(tǒng)分離得到的SA 2016026、SA 21016027、SA 2016028、SA 2016029、SA 2016030、SA 2016031、SA 2016040、SA 2016041、SA 2016047、SA 2016048、SA 2017001、SA 2016002等12株金黃色葡萄球菌鑒定分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,并由此看出SA 2016030、SA 2016047的擴(kuò)增曲線呈陽(yáng)性。

圖5 實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)分離菌株的鑒定實(shí)驗(yàn)Fig.5 Identification test of isolated strains by RTPCR注:1代表菌株SJTUF 20420;2代表實(shí)驗(yàn)室分離菌株SA 2016030;3代表DSM28299;4代表實(shí)驗(yàn)室分離菌株SA 2016047;曲線5～14分別為實(shí)驗(yàn)室分離的金黃色葡萄球菌SA 2016026、SA 21016027、SA 2016028、SA 2016029、SA 2016031、SA 2016040、SA 2016041、SA 2016048、SA 2017001、SA 2016002;曲線15為空白對(duì)照。

2.5 普通PCR檢測(cè)方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用文獻(xiàn)中提到的普通PCR檢測(cè)方法[12],對(duì)金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株,銀白色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株以及本實(shí)驗(yàn)鑒定得到的銀白色葡萄球菌(SA 2016030、SA 2016047)進(jìn)行檢測(cè),其中金黃色葡萄球菌的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度136 bp,而銀白色葡萄球菌的擴(kuò)增長(zhǎng)度為316 bp。擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示,銀白色葡萄球菌SJTUF 20420、DSM 28299、分離菌株SA 2016030和SA 2016047的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為316 bp,而金黃色葡萄球菌ATCC 27217、ATCC 25923、CMCC 26003、GIM 1.481的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為136 bp。所以,實(shí)驗(yàn)室分離菌株SA 2016030、SA2016047為銀白色葡萄球菌。

圖6 普通PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR amplicons of the nonribosomal peptide synthetase gene from different strains注:M代表Maker;1代表SJTUF 20420;2代表DSM 28299;3代表SA 2016030;4代表SA 2016047;5代表ATCC 25923;6代表為ATCC 27217;7代表為CMCC 26003;8代表GIM 1.481;NC為空白對(duì)照。

通過(guò)利用普通PCR檢測(cè)方法的驗(yàn)證,進(jìn)一步的證明本文所建立的方法具有極強(qiáng)的準(zhǔn)確性。雖然文獻(xiàn)中的PCR方法相比于傳統(tǒng)的多位點(diǎn)序列分型(MLST)的鑒定方法,節(jié)約時(shí)間,但其不足之處是在結(jié)果判定的過(guò)程中,容易引起污染,影響結(jié)果的判讀。而本文所建立的方法相對(duì)文獻(xiàn)中方法更快,并能通過(guò)熒光實(shí)時(shí)觀察。

2.6 模擬污染實(shí)驗(yàn)

將DSM28299銀白色葡萄球菌接種于含有新鮮奧爾良雞肉的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,過(guò)夜培養(yǎng),之后提取DNA模板,等梯度稀釋,分別對(duì)不同梯度的模板進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果表明,當(dāng)DNA模板濃度為0.01 ng/μL,結(jié)果呈現(xiàn)規(guī)則的,典型的擴(kuò)增曲線;而當(dāng)模板濃度為0.001 ng/μL時(shí),也就是1 pg/μL,雖然擴(kuò)增曲線與空白之間存在差異,但其Ct值偏大,與空白的差異不明顯,影響結(jié)果的判定。從而說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)污染樣品中銀白色葡萄球菌的靈敏度為0.01 ng/μL。

圖7 污染食品中銀白色葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)Fig.7 Sensitivity of RTPCR method for Staphylococcus argenteus in contaminated foods注:1～7分別代表DNA模板的濃度為101.4、10.2、1.0、0.1、0.01、0.001 ng/μL以及空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果。

3 結(jié)論

本研究利用銀白色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌在NRPS基因上的差異設(shè)計(jì)引物及探針,通過(guò)引物對(duì)的篩選及反應(yīng)體系的優(yōu)化,建立銀白色葡萄球菌的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,并利用建立的方法在對(duì)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)傳統(tǒng)生化鑒定得到的金黃色葡萄球菌分離菌株的鑒定,發(fā)現(xiàn)在12株原本鑒定為金黃色葡萄球菌中,存在2株銀白色葡萄球菌,且其檢出率相當(dāng)于金黃色葡萄球菌的1/6,進(jìn)一步證實(shí)銀白色葡萄球菌在我國(guó)的存在,為銀白色葡萄球菌的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ);在特異性實(shí)驗(yàn)中,可以檢測(cè)到銀白色葡萄球菌,葡萄球菌屬中同屬不同種以及其他不同屬的常見(jiàn)致病菌的擴(kuò)增結(jié)果全部呈陰性,且本方法對(duì)銀白色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到為10 pg/μL,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需60 min,可以短時(shí)間獲得檢測(cè)結(jié)果。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)建立的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性強(qiáng),靈敏度高,檢測(cè)時(shí)間短,操作簡(jiǎn)便,并且對(duì)樣品中分離菌株也能夠有效的區(qū)分,在實(shí)際檢測(cè)中具有很強(qiáng)的適用性,為銀白色葡萄球菌快速精準(zhǔn)的檢測(cè)提供可靠的技術(shù)手段,適合在檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)內(nèi)、食品安全監(jiān)管及食品加工等部門(mén)推廣應(yīng)用。

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