口腔鱗狀細(xì)胞癌中Dickkopf-3基因的表達(dá)及甲基化狀態(tài)

張素欣 張鑫 陳中 李天客 包陽 鄭晶 張雨溫

口腔頜面部惡性腫瘤中90%以上是口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell cancer，OSCC）［1］。據(jù)統(tǒng)計，中國每年新發(fā)的口腔頜面部惡性腫瘤病例約4.65萬人，5歲和70歲是兩個相對發(fā)病最高點(diǎn)［2］。雖然多學(xué)科綜合序列治療模式運(yùn)行多年，患者的5年生存率仍僅停留在60%左右，尋找代表腫瘤侵襲性及復(fù)發(fā)率的個性化生物標(biāo)志物，可以促進(jìn)針對性精準(zhǔn)治療，減少復(fù)發(fā)率，提高生存率［3］。

DKK-3是Wnt信號傳導(dǎo)通路的分泌性拮抗劑之一［4］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn) DKK-3基因在食管癌［5］、肺癌［6］等組織中存在異常甲基化，但該基因在口腔黏膜鱗癌中的表達(dá)及甲基化狀態(tài)鮮有問津，本實驗通過應(yīng)用RT-PCR和MSP技術(shù)檢測口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中DKK-3基因mRNA的表達(dá)和啟動子甲基化狀態(tài)，并分析mRNA表達(dá)和甲基化與臨床資料之間的關(guān)系，探討該基因的存在狀態(tài)在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為腫瘤靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

隨機(jī)選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科2014-09～2015-12期間51例經(jīng)手術(shù)治療的初診原發(fā)口腔鱗癌患者為研究對象，標(biāo)本均經(jīng)病理證實。所有標(biāo)本均為術(shù)后立即取材，－80℃冰箱中凍存。發(fā)病部位包括舌、牙齦、頰等部位，年齡在31～88歲之間，中位年齡58歲，男女性別比為1.43∶1。Ⅰ期9例，Ⅱ期27例，Ⅲ期6例，Ⅳ期9例。本實驗已獲得患者及家屬的知情同意。

1.2 主要試劑

5-氮-2′-脫氧胞苷 （5-aza-2deoxycytidine，5-AzadC）、氫醌、亞硫酸氫鈉（Sigma，美國）；蛋白酶 K（Merck，德國）；Wizard DNA純化試劑盒（Promega，美國）；Trizol（Invitrogen，美國），引物（北京賽百勝公司合成）；即用型免疫組織化學(xué)SP試劑盒（SP-9000）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 MSP法檢測 提取組織DNA并進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，設(shè)計甲基化及非甲基化引物進(jìn)行MSP檢測，上下游引物各包含3個CG位點(diǎn)（圖1）。DKK-3基因甲基化引物為：上游 5′-GGGGCGGGCGGCGGGGC-3′，下游 5′-ACATCTCCGCTCTACGCCCG-3′；非甲基化引物為：上游 5′-TTAGGGGTGGGTGGTG GGGT-3′，下游5′-CTACATCTCCACTCTACACCCA-3′。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min后，94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s，40個循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸10 min。用經(jīng)甲基化酶（Sss I）處理以后的基因組DNA作為甲基化的陽性對照，陰性對照則用滅菌雙蒸水取代DNA模板進(jìn)行PCR。另隨機(jī)選取10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實驗以驗證結(jié)果的可靠性。

圖1 DKK-3基因的CpG島分布Fig 1 CpG island of DKK-3 gene distribution

1.3.2 RT-PCR檢測 按Trizol試劑說明書提取組織總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （Reverse Transcription SystemA 3500，Promega公司）說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用于檢測DKK-3基因mRNA的引物為：上游5′-ACAGCCACAGCCTG GTGTA-3′， 下 游 5′-CCTCCATGAAGCTGCCAAC-3′（120 bp）。內(nèi)參照 GAPDH的引物為：上游 5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游 5′-AGGGGTC ATTGATGGCAACA-3′（104 bp）。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min后，94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，GAPDH作為內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用配對t檢驗方法，計數(shù)資料用χ2檢驗。均采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DKK-3基因mRNA在OSCC組織及正常口腔黏膜中的相對表達(dá)量（圖2）

DKK-3基因mRNA在OSCC組織中的相對表達(dá)量為（0.41±0.27），在其對應(yīng)正?？谇火つぶ邢鄬Ρ磉_(dá)量為（0.50±0.29），二者差異顯著（P＜0.05）。

DKK-3基因mRNA在OSCC組織中的相對量表達(dá)情況與臨床特征之間的關(guān)系（表1）。

吸煙組、臨床Ⅲ期、Ⅳ期組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組DKK-3基因 mRNA的相對表達(dá)量分別為（0.22±0.16）、（0.28±0.19）、（0.24±0.17），均明顯低于對照組（P＜0.05），表達(dá)量與性別和年齡無關(guān)。

圖2 DKK-3 mRNA在口腔鱗癌及正常黏膜組織中的表達(dá)Fig 2 The expression of DKK-3 mRNA in OSCC and normal oral mucosa tissue

表1 DKK-3 mRNA的表達(dá)與口腔鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系Tab 1 The relationship between DKK-3 mRNA expression and clinical data in OSCC tissue

2.2 口腔鱗癌組織和正?？谇火つぶ蠨KK-3基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)（圖3）

DKK-3基因啟動子區(qū)在OSCC組織中的甲基化率為49.0%（25／51），明顯高于其對應(yīng)正?？谇火つそM織的甲基化率7.8%（4／51）（P＜0.05）（表 2）。

OSCC組織中DKK-3基因啟動子區(qū)甲基化情況與臨床特征之間的關(guān)系（表3）。

圖3 DKK-3基因在口腔鱗癌及正常黏膜組織中的甲基化狀態(tài)Fig 3 Methylation analysis of DKK-3 gene in OSCC and normaloralmucosa tissue

表2 DKK-3在口腔鱗癌及正?？谇火つそM織中不同的甲基化狀態(tài)Tab 2 The difference of the DKK-3 methylation between OSCC and normal oralmucosa tissue

吸煙組、臨床Ⅲ期、Ⅳ期組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的甲基化率分別為 64.3%、73.3%、50.0%，均明顯高于對照組，甲基化率與性別、年齡及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）。

2.3 DKK-3基因mRNA相對表達(dá)量與甲基化陽性率的關(guān)系

DKK-3基因mRNA在甲基化陽性病例中的相對表達(dá)量為0.30±0.21，在對照組表達(dá)量為0.51±0.29（P＜0.05）。

表3 DKK-3甲基化狀態(tài)與口腔鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系Tab 3 The relationship between DKK-3 methylation and chinical data of OSCC

3 討 論

表觀遺傳是通過DNA甲基化、組蛋白修飾等方式有選擇性地調(diào)控目的基因的表達(dá)，促使腫瘤的發(fā)生［7］。其中DNA甲基化的基因表觀修飾方式，集中發(fā)生在CpG島，啟動子區(qū)CpG島的高甲基化是引起抑癌基因表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制之一［8］。

DKK-3屬于DKK家族，位于染色體11P15.1位點(diǎn)，全長47 100 bp，該家族大都通過競爭性結(jié)合特異性受體來有效的抑制Wnt信號傳導(dǎo)通路［9］，從而參與調(diào)控機(jī)體的生物學(xué)行為。DKK-3在肝癌、乳腺癌等組織中表現(xiàn)為下調(diào)和缺失［10－11］，本實驗發(fā)現(xiàn)，DKK-3基因mRNA在OSCC中的相對表達(dá)量明顯低于對照組，而且該基因在癌組織中表達(dá)量的高低與臨床分期及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移明顯有關(guān)，表明DKK-3表達(dá)降低可能是口腔癌發(fā)展過程中的一個重要事件，隨著病變的進(jìn)展，DKK-3基因mRNA的表達(dá)逐漸降低甚至沉默，提示DKK-3基因在OSCC中可能作為抑癌基因而存在，推測它的調(diào)控機(jī)制可能是因為DKK-3基因編碼的蛋白是Wnt受體復(fù)合物的對抗物，DKK-3基因表達(dá)的下調(diào)使其編碼的蛋白無法有效對抗Wnt受體復(fù)合物，使得游離態(tài) β-catenin在胞內(nèi)聚集，Wnt通路被異常激活，作用于下游靶基因，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為［12］。也就是說，DKK-3基因可能是通過調(diào)控Wnt信號傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵因子βcatenin的表達(dá)來異常激活經(jīng)典Wnt通路，從而促進(jìn)口腔癌的發(fā)生。

那么是什么原因?qū)е铝薕SCC組織中DKK-3基因表達(dá)的下降呢？本研究應(yīng)用MethPrimer軟件對DKK-3基因進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示DKK-3基因含有9個外顯子，該基因的啟動子區(qū)和第1外顯子區(qū)富含CpG島，因此有理由懷疑該基因的異常甲基化可能是其表達(dá)下調(diào)的機(jī)制之一，于是又檢測了DKK-3啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示OSCC組織中DKK-3基因的甲基化率明顯高于對照組，而且與臨床分期有關(guān)，說明隨著口腔癌的不斷進(jìn)展，DKK-3基因甲基化狀態(tài)也不斷突顯，警示不良預(yù)后。另外，DKK-3基因mRNA在其甲基化陽性病例中的相對表達(dá)量顯著低于對照組，分析原因可能是啟動子區(qū)CpG島5＇末端調(diào)控序列甲基化后阻礙了轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合，降低了該基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而使其表達(dá)下降甚至不表達(dá)，即DKK-3基因啟動子區(qū)CpG島的高甲基化可能是導(dǎo)致該基因表達(dá)下降甚至不表達(dá)的關(guān)鍵因素之一，間接參與了口腔癌的發(fā)生與發(fā)展。

因此，本研究認(rèn)為以DNA甲基化為代表的表觀遺傳沉默是口腔癌發(fā)生發(fā)展中的重要機(jī)制之一，可以應(yīng)用去甲基化藥物逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞中DNA的異常高甲基化狀態(tài)，修復(fù)抑癌基因的正常表達(dá)，從而控制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［13－14］，但其可行性需進(jìn)一步探索及證實。

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