全自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜測(cè)定蔬菜中滅蠅胺殘留

◎ 董　嬌，曹寧陽(yáng)，耿　鑫

（1.沈陽(yáng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，遼寧　沈陽(yáng)　110072；2.沈陽(yáng)食品檢驗(yàn)所，遼寧　沈陽(yáng)　110136）

滅蠅胺（Cyromazine），化學(xué)名稱(chēng)N-環(huán)丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一種三嗪類(lèi)有機(jī)化合物。滅蠅胺有很好的選擇性，主要對(duì)雙翅目類(lèi)昆蟲(chóng)有活性。其機(jī)理是使雙翅目類(lèi)昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)及其蛹在形態(tài)上發(fā)生畸變，成蟲(chóng)羽化不全或受抑制。主要用于防治葉菜類(lèi)、菜豆類(lèi)和瓜果類(lèi)的美洲斑潛蠅和潛葉蠅等農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。滅蠅胺以其高效、低毒性、低殘留、持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，得到了世界范圍內(nèi)的認(rèn)可，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蔬菜蠅蛆的防治。GB 2763-2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定滅蠅胺的限量指標(biāo)：黃瓜中的最大殘留限量值為1.0 mg/kg，其他豆類(lèi)蔬菜限量值為0.5 mg/kg。

目前，滅蠅胺檢測(cè)方法主要有HPLC法、HPLC-MS/MS法和GC-MS法，樣品前處理方法則基本都采用固相萃取法，而手動(dòng)固相萃取操作存在自動(dòng)化程度低、處理能力有限、重現(xiàn)性差等缺陷。本文采用全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行萃取操作，相對(duì)于傳統(tǒng)的手動(dòng)固相萃取方式，全自動(dòng)固相萃取法降低了樣品用量，實(shí)現(xiàn)了樣品的自動(dòng)化在線(xiàn)前處理，既節(jié)省了時(shí)間，又避免了操作人員直接接觸有機(jī)溶劑。同時(shí)，操作簡(jiǎn)便，減少人為因素引入的誤差，重現(xiàn)性好，大大提高了分析效率。

1　材料與方法

1.1　儀器與試劑

儀器：島津LC20A高效液相色譜儀，配有M20A二極管陣列檢測(cè)器；Sepline-s1全自動(dòng)固相萃取儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；HZF-A500電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；均質(zhì)機(jī)，T18德國(guó)IKA公司；MV5多通道平行濃縮儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

試劑：SCX固相萃取柱，6 mL，500 mg，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Florisil固相萃取柱，6 mL，500 mg，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；滅蠅胺，純度98.0%，德國(guó)Dr .Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇，色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氨水、鹽酸，分析純，西隴化工股份有限公司；水，高純水。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100 mg/L）：準(zhǔn)確稱(chēng)取滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加入乙腈定容至刻度。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液50 μL、100 μL、200 μL、0.5 mL、2.0 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。配制成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、2.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液[1]。

1.2.2樣品的預(yù)處理及提取

將蔬菜樣品取可食部分，擦去樣品表面的附著物，切碎，充分混勻，搗成勻漿。勻漿放入聚乙烯瓶中于-20～-16 ℃下保存。稱(chēng)取樣品時(shí)，常溫樣品攪拌均勻，冷凍樣品解凍后混勻取樣。

稱(chēng)取勻漿樣品20 g（精確至0.01 g）于250 mL三角瓶中，加入40 mL甲醇-水溶液(9∶1，V/V)，高速均質(zhì)2 min，濾液經(jīng)墊有濾紙的布式漏斗抽濾至100 mL具塞比色管中，再用25 mL上述混合溶液清洗燒杯和均質(zhì)器刀頭，高速均質(zhì)30 s，濾液經(jīng)留有殘?jiān)牟际下┒烦闉V，合并濾液于100 mL具塞比色管中，加入8 mL 0.5 mol/L鹽酸，采用甲醇-水溶液(9∶1，V/V)定容，取出5 mL提取液至試管中待凈化[2]。

1.2.3提取液的凈化及濃縮

按表1中程序應(yīng)用全自動(dòng)固相萃取儀對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。凈化后的提取液在平行濃縮儀上40 ℃吹干，用流動(dòng)相定容至1 mL。

表1　自動(dòng)固相萃取凈化程序表

1.2.4HPLC分析條件

色譜柱，Thermo Hypersil APS2（NH2）氨基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相，乙腈+水(97+3，V/V)；流速，1 mL/min；柱溫，30 ℃；進(jìn)樣體積，10 μL；檢測(cè)器，二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)，210 nm[3]。

中央門(mén)衛(wèi)生服務(wù)中心（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“中心”）是集醫(yī)療、康復(fù)為一體的二級(jí)綜合性醫(yī)院，覆蓋鼓樓區(qū)8個(gè)社區(qū)7萬(wàn)多人口。隨著醫(yī)院醫(yī)療水平和服務(wù)質(zhì)量的逐步提升，門(mén)診和住院病人持續(xù)增加，原有的醫(yī)療檢測(cè)設(shè)備已經(jīng)不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的醫(yī)療市場(chǎng)需求。充分考慮中心的臨床實(shí)際需求，結(jié)合中心的發(fā)展，2015年年底，中心引進(jìn)了0.35T核磁共振成像儀（MRI），總投資204萬(wàn)元。為加強(qiáng)對(duì)MRI的運(yùn)行管理，提高設(shè)備使用效率，探索大型檢測(cè)設(shè)備成本運(yùn)行規(guī)律，為中心宏觀經(jīng)濟(jì)管理和長(zhǎng)期發(fā)展戰(zhàn)略提供決策參考，文章對(duì)核磁共振項(xiàng)目進(jìn)行了綜合效益分析。

2　結(jié)果與討論

2.1　全自動(dòng)固相萃取儀條件優(yōu)化

2.1.1固相萃取柱的選擇

考慮到蔬菜樣品中含有較多色素，而滅蠅胺為三嗪類(lèi)弱堿性化合物，所以本文選擇了Florisil小柱和SCX小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)表明，SCX固相萃取柱對(duì)滅蠅胺的萃取效果較好，回收率較高，使用該型小柱所得萃取液干擾雜質(zhì)較少。因?yàn)镾CX固相萃取柱鍵含有苯磺酸官能團(tuán)，所以上樣時(shí)，樣品溶液pH值會(huì)影響滅蠅胺在小柱上的吸附。本文通過(guò)在樣品提取液中加入8mL 0.5 mol/L鹽酸溶液，將提取液的pH值控制在2～3（不同基質(zhì)pH值稍有差別），以保證其帶電荷，使滅蠅胺在洗脫之前能夠更好地保留在小柱上。Florisil小柱除去樣品中的色素效果明顯，但目標(biāo)物滅蠅胺的回收率低于采用SCX小柱時(shí)所得到的結(jié)果。應(yīng)用兩種固相萃取小柱凈化的方法檢出限沒(méi)有數(shù)量級(jí)上的差別。綜合考慮以上因素，本方法選擇SCX小柱作為凈化柱[4]。

2.1.2固相萃取條件優(yōu)化

由于葉菜類(lèi)和豆莢類(lèi)樣品含有色素較多，當(dāng)上樣量太大容易使小柱穿透，本方法選擇上樣體積為5 mL。應(yīng)用SCX小柱進(jìn)行凈化時(shí)，保持目標(biāo)物帶有電荷可以更好地使目標(biāo)物吸附在小柱上，有效提高回收率。實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同淋洗液的淋洗效果進(jìn)行了比對(duì)，在其他條件相同的情況下，分別采用0.1 mol/L的鹽酸和純水作為淋洗液進(jìn)行淋洗，對(duì)目標(biāo)物回收率的影響并不明顯。同時(shí)，考慮到溶劑的環(huán)境友好性，最終選擇采用純水進(jìn)行第一次淋洗，再用甲醇進(jìn)行第二次淋洗，用以除去提取液中的極性干擾物質(zhì)。SCX柱的洗脫液應(yīng)為堿性溶液，一般為不同配比的氨水-甲醇洗脫液[5]。本文比較了5%的氨水-甲醇、10%氨水-甲醇、20%氨水-甲醇洗脫液，發(fā)現(xiàn)體積比為5∶95時(shí)洗脫效果較好，回收率高。應(yīng)用5 mL上述5%的氨水-甲醇洗脫液，洗脫3次和洗脫兩次的回收率分別為86%和82%，為減少有機(jī)試劑的使用量，本文選擇5 mL 5%的氨水-甲醇洗脫兩次作為洗脫程序[6]。上樣流速和洗脫流速也會(huì)影響目標(biāo)物回收率。上樣速度太快，樣品來(lái)不及與小柱作用就流出小柱，降低回收率。洗脫速度過(guò)快，洗脫溶劑沒(méi)有時(shí)間和目標(biāo)物充分接觸，無(wú)法將樣品從小柱上充分洗脫下來(lái)，也會(huì)降低目標(biāo)物回收率。本文充分考慮上述影響條件，確定上樣及洗脫的流速分別為1、2 mL/min[7]。

2.2　線(xiàn)性范圍及檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按1.2.4色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以對(duì)應(yīng)的色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)（Y，響應(yīng)值）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL）進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明：滅蠅胺在濃度0.05～2.0 μg/mL呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=9.09e-006X+0.0075，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（r）為0.9995。方法檢出限為0.02 mg/kg（信噪比RSN=3）。滅蠅胺的高效液相色譜圖，如圖1所示[8]。

圖1　濃度為1.0 mg/L的滅蠅胺高效液相色譜圖

2.3　加標(biāo)回收率及精密度

選取黃瓜、土豆、豇豆3種蔬菜，按1.2.2及1.2.3進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)[9]。每種蔬菜選取中低高3個(gè)濃度，每個(gè)濃度分析6個(gè)樣品，每個(gè)樣品均應(yīng)用手動(dòng)和自動(dòng)固相萃取兩種凈化方式，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　3種蔬菜回收率及精密度結(jié)果表

3　結(jié)論

參考文獻(xiàn)：

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