黏附分子CD44和ICAM- 1在肺炎支原體感染BALB/c小鼠體內(nèi)表達(dá)及相關(guān)機(jī)制*

鄧世群，趙世元，張幫獻(xiàn)　

(1.廣西南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)石埠衛(wèi)生院檢驗(yàn)科，南寧　530008；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧　530001)

肺炎支原體(mycoplasmapneumonia，MP)感染主要引起支氣管炎和非典型肺炎。有關(guān)MP感染機(jī)制還不是很明了。研究表明，MP感染刺激巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子和黏附分子刺激氣道，使氣道發(fā)生持續(xù)性炎癥，加速氣道重建[1～3]。細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules CAMs)是一類能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與外基質(zhì)相互黏附的糖蛋白，在炎癥反應(yīng)中，介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)移[4]。有關(guān)細(xì)胞黏附分子在肺炎支原體肺炎的表達(dá)國內(nèi)報(bào)道尚少。本研究通過小鼠感染模型檢測(cè)血清和肺泡灌洗液(BALF)中黏附分子CD44和ICAM- 1的表達(dá)，并探討CD44和ICAM- 1的表達(dá)與MP感染的相關(guān)性，為MP感染機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c小鼠，SPF級(jí)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016- 009。BALB/c小鼠5周齡，20±2 g，雌雄各半。小鼠在廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑：PPLO肉湯培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司提供；MP菌液，上海寶米科生物科技有限公司提供；替加環(huán)素，Wyeth Pharmaceuticals，Madison，NJ提供；CD44和ICAM- 1試劑盒購于美國R&D公司。

1.1.3儀器：酶標(biāo)儀，上海科華生產(chǎn)，型號(hào)：MK3。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1MP的培養(yǎng)：MP在每瓶20 ml的SP4肉湯于37℃ 5%(v/v)CO2培養(yǎng)72 h后，肉湯變成橙色，倒出上清液，加新鮮的SP4肉湯2 ml到燒瓶，收集貼壁存活MP。將MP配成108～109CFU/ml，加制霉菌素(50 U/ml)和氨芐青霉素(1 mg/ml)，樣本保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2動(dòng)物模型的建立：實(shí)驗(yàn)方案由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，所有的動(dòng)物按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南處理。新購的BALB/c小鼠在新環(huán)境下適應(yīng)3天。將90只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和替加環(huán)素治療組，每組30只。對(duì)照組小鼠第1天、5天和8天皮下注射無菌生理鹽水50 μl。模型組、替加環(huán)素治療組小鼠第1天滴鼻接種含1×107CCU/ml MP菌液各50 μl；第5天、8天接種含1×107CCU/ml MP菌液各100 μl。替加環(huán)素治療組小鼠于第9天起首次皮下注射替加環(huán)素10 mg/kg(0.2 g溶于5 g/ml葡萄糖注射液0.1 ml，即0.05 ml/g)，以后每天按5 mg/kg連續(xù)6天皮下注射。模型組在相同時(shí)間注射等體積的生理鹽水。用藥期間觀察各組小鼠的存活率、進(jìn)食量、飲水量、活動(dòng)量、精神狀態(tài)、是否有豎毛、寒戰(zhàn)、咳嗽，口、鼻分泌物數(shù)量是否增加等。在小鼠5，8，15，20和30天，各組分別取5只小鼠，用乙酰丙嗪氯胺酮按5 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后用25號(hào)針頭將500 μl SP4肉湯注入肺部，隨后又將該液抽吸到注射器，BALF離心吸上清并儲(chǔ)存在-80℃冰箱；小鼠眼眶取血，30 min后離心分離血清，血清儲(chǔ)存在-80℃冰箱。肺標(biāo)本用10 ml/dl福爾馬林溶液固定進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。

1.2.3指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1MP小鼠情況觀察：小鼠接種MP后，每天觀察小鼠存活情況、進(jìn)食量、飲水量、活動(dòng)度、排便以及有無咳嗽等癥狀。

1.2.3.2肺組織HPS病理評(píng)分和肺實(shí)質(zhì)評(píng)分：肺組織經(jīng)10 ml/dl福爾馬林固定，石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木精- 伊紅染色。肺組織病理學(xué)評(píng)分(HPS)由專業(yè)病理醫(yī)師雙盲鏡檢。HPS分級(jí)基于細(xì)支氣管支氣管浸潤數(shù)目，細(xì)支氣管支氣管管腔滲出程度，血管周圍浸潤百分率和實(shí)質(zhì)性肺炎嚴(yán)重程度(中性粒細(xì)胞肺泡浸潤)；該HPS系統(tǒng)分值從0～26，分?jǐn)?shù)越高代表肺組織炎性浸潤程度越高。實(shí)質(zhì)性肺炎的得分是基于分級(jí)的中性粒細(xì)胞肺泡浸潤(評(píng)分：0.沒有實(shí)質(zhì)性肺炎；3.片狀實(shí)質(zhì)性肺炎；5.片狀融合實(shí)質(zhì)性肺炎)。

1.2.3.3各組小鼠BALF中細(xì)胞因子的檢測(cè)：采用ELISA法測(cè)定血清和BALF中CD44，ICAM- 1等黏附分子的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2　結(jié)果

2.1小鼠接種情況 BALB/c小鼠接種MP后第1天，精神狀態(tài)略差，活動(dòng)減少，進(jìn)食量和排便量減少，無咳嗽等呼吸道癥狀；第3～5天小鼠鼻腔出現(xiàn)少許分泌物并出現(xiàn)咳嗽；小鼠第8天出現(xiàn)乏力，精神狀態(tài)較差，活動(dòng)減少，進(jìn)食減少，大便稍稀，鼻腔分泌物增多，出現(xiàn)咳嗽、豎毛、發(fā)冷等癥狀，說明造模成功。MP小鼠經(jīng)替加環(huán)素治療6天后，小鼠的精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，咳嗽寒顫等癥狀逐漸減少，進(jìn)食和活動(dòng)量逐漸增加。

2.2各組肺組織HE染色和肺組織病理評(píng)分PM感染小鼠5天，小鼠肺組織HPS評(píng)分和實(shí)質(zhì)性肺炎評(píng)分明顯升高，到8天達(dá)到高峰；用替加環(huán)素治療肺炎支原體肺炎小鼠，小鼠肺組織HPS評(píng)分和實(shí)質(zhì)性肺炎評(píng)分明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HPS評(píng)分P=0.035，實(shí)質(zhì)性肺炎評(píng)分P=0.004；尤其是治療6天后小鼠肺組織HPS評(píng)分和實(shí)質(zhì)性肺炎評(píng)分降低非常明顯與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HPS評(píng)分P=0.002，實(shí)質(zhì)性肺炎評(píng)分P=0.025)。

2.3各組小鼠血清和肺泡灌洗液中(BALF)黏附分子CD44和ICAM- 1表達(dá)水平見表1。BALB/c小鼠感染MP 5天、8天，其血清和BALF中CD44和ICAM- 1明顯上升，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.000)。造模成功后，用替加環(huán)素治療感染MP小鼠6天，MP小鼠血清和BALF中CD44和ICAM- 1表達(dá)與模型組比較明顯下調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.000)，MP小鼠用替加環(huán)素治療12天，其血清和BALF中CD44和ICAM- 1表達(dá)與模型組比較明顯下調(diào)(均P<0.000)。MP小鼠用替加環(huán)素治療21天，其血清和BALF中CD44和ICAM- 1表達(dá)與模型組比較明顯下調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.000。

表1 各組小鼠血清和肺泡灌洗液中CD44和ICAM- 1表達(dá)水平(n=5)

3　討論

肺炎支原體(MP)是非典型肺炎的病原體，兒童和青少年容易引起其他呼吸道感染如支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎、喉炎等。病人咳嗽、發(fā)燒和頭痛可能持續(xù)數(shù)周，恢復(fù)緩慢。據(jù)估計(jì)，在社區(qū)獲得性肺炎中肺炎支原體肺炎約占30%。肺炎支原體肺炎四季發(fā)病并小規(guī)模流行，嬰幼兒上呼吸道感染為主，青少年以支氣管炎和肺炎為主，成年以肺炎多見。

肺炎支原體肺炎其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為入侵的支原體經(jīng)呼吸道上皮細(xì)胞黏附、局部宿主細(xì)胞損傷和過度的不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)似乎有助于肺炎支原體感染的發(fā)病機(jī)制。MP感染刺激巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子和黏附分子刺激氣道，使氣道發(fā)生持續(xù)性炎癥，加速氣道重建。MP對(duì)人類宿主呼吸道上皮的黏附是呼吸道上皮細(xì)胞定植和隨后誘導(dǎo)疾病的先決條件[5，6]。

黏附分子(adhesion molecules，AM)是由細(xì)胞產(chǎn)生的并在細(xì)胞表面存在，能介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞、細(xì)胞和基質(zhì)之間相互融合的一類分子。黏附分子在炎癥性炎癥和免疫調(diào)節(jié)過程中起重要作用：它可參與呼吸道炎癥反應(yīng)，作為病毒受體介導(dǎo)病毒感染，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。在肺炎發(fā)作時(shí)，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的特異黏附分子促進(jìn)氣道黏膜炎癥細(xì)胞的聚集；而細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)反饋?zhàn)饔脝?dòng)這些粘附分子[7]。

黏附分子CD44是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白分子的未分類的黏附分子，其基本功能是參與細(xì)胞和基質(zhì)之間、細(xì)胞與細(xì)胞的特異性黏連過程。CD44分子參與細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移，在炎癥反應(yīng)過程中CD44表達(dá)上調(diào)，與透明質(zhì)酸(hyaluronan，HA)配體緊密結(jié)合[7]。哮喘急性發(fā)作使肺部血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌CD44增加并釋放入血，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞向氣道趨化可增高氣道反應(yīng)性、促進(jìn)淋巴細(xì)胞及其他炎癥因子募集，加重支氣管的痙攣程度及喘息癥狀[9]。

黏附分子- 1，又稱細(xì)胞間黏附分子- 1(intercellular adhesion molecule，ICAM- 1)，屬于免疫球蛋白超家族。ICAM- 1是炎癥反應(yīng)過程中的極為重要組成部分：ICAM- 1與白細(xì)胞表面的巨噬細(xì)胞分化抗原- 1(macrophages differentiation antigen- 1，Mac- 1)和相應(yīng)受體淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原- 1(lymphocyte function associated antigen- 1，LFA- 1) 結(jié)合，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞滲出，參與炎癥反應(yīng)[10]；ICAM- 1表達(dá)上調(diào)使炎癥細(xì)胞在氣道募集和黏附，觸發(fā)炎癥反應(yīng)[11]；此外，ICAM- 1還參與傳遞胞外- 胞內(nèi)信號(hào)，使胞內(nèi)蛋白磷酸化、誘導(dǎo)蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子活化，從而產(chǎn)生大量的生物學(xué)活性。博萊霉素(bleomycin，BLM)上調(diào)大鼠肺纖維化模型血清中黏附分子ICAM- 1，與其配體結(jié)合促使嗜酸性粒細(xì)胞向氣道內(nèi)趨化，參與了肺泡炎癥反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性及氣道結(jié)構(gòu)重建[12]。

本實(shí)驗(yàn)采用與人基因結(jié)構(gòu)相似的BALB/c小鼠作為造模對(duì)象，BALB/c小鼠的遺傳背景為近交系，親近繁殖，遺傳基因更純，個(gè)體差異小，對(duì)MP敏感。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在MP感染5～8天，小鼠血清和BALF中CD44，ICAM- 1水平明顯升高(P<0.01)，MP感染14天，小鼠血清和BALF中CD44，ICAM- 1水平升高到最高值(P<0.01)，隨著病情的發(fā)展，肺組織的持續(xù)纖維化，小鼠血清和BALF中CD44，ICAM- 1水平持續(xù)下降；用替加環(huán)素治療MP感染小鼠后，小鼠血清和BALF中CD44，ICAM- 1水平明顯下降，與模型組比較差異非常顯著(P<0.01)，肺組織病理檢查可見肺部炎癥減輕。表明MP感染小鼠后其血清和BALF中CD44，ICAM- 1水平與MP感染程度有關(guān)。其作用機(jī)制可能是當(dāng)肺炎支原體感染時(shí)，入侵的支原體經(jīng)呼吸道上皮細(xì)胞黏附，CD44調(diào)節(jié)細(xì)胞游走，可通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞在肺泡和肺間質(zhì)內(nèi)浸潤，引起外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能異常、淋巴細(xì)胞亞群間比例失衡，并上調(diào)炎癥因子IGF- 1，TNF- α，IL- 1β，IL- 8加劇炎癥反應(yīng)程度，嗜酸性粒細(xì)胞在氣道過度聚集引起多種炎癥介質(zhì)表達(dá)上調(diào)，其中PAF水平增高可致細(xì)氣管收縮。ICAM- 1機(jī)制可能與其配體融合促使嗜酸性粒細(xì)胞向氣道內(nèi)趨化、浸潤并釋放PAF，參與炎癥反應(yīng)。

綜上所述，MP感染BALB/c小鼠后其血清和BALF中黏附分子CD44，ICAM- 1表達(dá)上調(diào)，CD44，ICAM- 1可能參與MP感染的病理生理過程，引起機(jī)體炎癥。MP感染后CD44，ICAM- 1表達(dá)下調(diào)可能成為判斷MP感染預(yù)后指標(biāo)之一。

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