貴州地區(qū)孕晚期婦女生殖道無乳鏈球菌定植篩查及CAMP試驗陰性的GBS菌株基因測序分析研究*

劉家玲，袁　軍，胡方芳　

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義　563000；2.貴陽市第二人民醫(yī)院，貴陽　550001；3.貴州省人民醫(yī)院，貴陽　550001)

無乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)又稱為B群鏈球菌(group Bstreptococcus，GBS)，定植在孕晚期婦女泌尿生殖道可引起孕婦發(fā)生早產(chǎn)、胎膜早破、產(chǎn)褥感染等，在孕婦分娩的過程中經(jīng)過垂直傳播可引起新生兒發(fā)生嚴(yán)重的侵襲性感染，如新生兒敗血癥、腦膜炎、肺炎等[1]。在新生兒感染中有較高致死率、致殘率，并且相較其他細(xì)菌引起的新生兒感染，GBS感染患兒的住院時間更長，對患兒的家庭經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[2]。因此，對孕35～37周婦女進(jìn)行常規(guī)GBS定植篩查可以有效的預(yù)防新生兒感染的發(fā)生[3]。為了解貴州地區(qū)孕晚期婦女生殖道GBS的定植情況及耐藥性，為臨床合理用藥及預(yù)防新生兒GBS感染提供依據(jù)。2016年5月～2017年5月收集貴州省人民醫(yī)院產(chǎn)科門診孕35～37周婦女生殖道分泌物樣本3 794例進(jìn)行GBS的分離培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗，并對收集到的CAMP陰性的GBS進(jìn)行了系統(tǒng)化的鑒定，結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1研究對象連續(xù)收集2016年5月～2017年5月貴州省人民醫(yī)院產(chǎn)科門診及住院孕35～37周婦女生殖道分泌物拭子。樣本采集工作由產(chǎn)科醫(yī)生完成。

1.2試劑和儀器BD Phinxo100全自動細(xì)菌鑒定儀，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force HF160W)，哥倫比亞血平板，購自廣州迪景；革蘭染液，購自BD公司；15 μg/片紅霉素、2 μg/片克林霉素，購自英國OXOID；CAMP試驗指示菌株為ATCC25923；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及2×Taq PCR MasterMix購自天根生物；100bp DNA Lander 購自Takara；GoldView II型核酸染色劑購自SolarbioTM科技有限公司；瓊脂糖凝膠(Regular AGAROSE G- 10)購自BiowestTM科技有限公司；BIO- RAD T100TMThermal Cycler PCR擴(kuò)增儀。

1.3方法

1.3.1分離鑒定體外藥敏試驗及大環(huán)內(nèi)酯類耐藥表型檢測：將收集到的孕晚期婦女生殖道拭子接種于哥倫比亞血平板，置于35℃，5 ml/dl CO2培養(yǎng)箱中孵育18～24 h。挑取可疑菌落分離純化后進(jìn)行革蘭染色鏡檢及觸酶試驗，對革蘭染色呈陽性球菌、觸酶試驗陰性者做CAMP試驗，同時應(yīng)用BD Phinxo100全自動細(xì)菌鑒定儀及配套的鏈球菌鑒定及藥敏卡進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗，納入的藥物包括：青霉素、紅霉素、克林霉素、萬古霉素、頭孢吡肟、頭孢噻肟、左氧氟沙星、氯霉素、阿莫西林、利奈唑胺。按照CLSI(2016版)標(biāo)準(zhǔn)用常規(guī)紙片擴(kuò)散法對儀器檢測藥敏結(jié)果為紅霉素耐藥、克林霉素敏感的菌株進(jìn)行D試驗。將15 μg/片的紅霉素、2 μg/片的克林霉素貼在相鄰的位置，間距12～15 mm，35℃ 5～10 ml/dl CO2孵育18～24 h，紅霉素耐藥，靠近紅霉素紙片處克林霉素抑菌圈截平呈D形抑菌環(huán)，報告D試驗陽性。

1.3.2CAPM試驗陰性菌株的16SrDNA序列分析鑒定：收集到的CAMP試驗陰性的GBS，參考Hongoh等[4，5]報道，擴(kuò)增16srDNA引物。引物序列為：27F： 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’；1492R：5’- GGTTACCTTGTTACGACTT- 3’。將分離到的菌株進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取后作為模板進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增，目的片段大小為1 540 bp。PCR反應(yīng)體系25 μl：2×Taq MasterMix 12.5 μl，模板1 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃穩(wěn)定10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)南京金斯瑞生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。利用MEGA 5.0軟件對同源相近的鏈球菌的16SrDNA序列構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3.3cfb基因檢測：參考文獻(xiàn)中報道的編碼CAMP因子的cfb基因引物[5，6]，引物序列cfbF：5’- ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG- 3’；cfbR：5’- CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC- 3’，對分離得到的CAMP試驗陰性的菌株進(jìn)行cfb基因的檢測，預(yù)期的目的片段大小為260 bp。PCR反應(yīng)體系25 μl：2×Taq MasterMix 12.5 μl，模板1 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃穩(wěn)定10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)含有EB的1.0 g/dl瓊脂糖凝膠電泳后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察是否有特異性條帶，后由金斯瑞(南京)生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線比對分析。

1.3.4質(zhì)量控制：質(zhì)量控制菌株使用肺炎鏈球菌ATCC49619，儀器和試驗質(zhì)量控制均在控。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析使用whonet 5．6軟件對藥敏結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

2　結(jié)果

2.1無乳鏈球菌的分離率、耐藥性及耐藥表型3 794份樣本共分離出無乳鏈球菌118株，檢出率為3.11%。118株GBS的藥敏結(jié)果顯示對青霉素、萬古霉素、阿莫西林、頭孢吡肟和頭孢噻肟的敏感度均為100%，對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素分別有不同程度的耐藥，其耐藥率依次為：81.3%，62.7%，72.9%，21.2%。118株菌中對紅霉素和(或)克林霉素耐藥的菌株為99株，其中紅霉素和克林霉素同時耐藥的74株，即cMLS型74.7%；對紅霉素耐藥、克林霉素敏感的25株；共25株菌進(jìn)行大環(huán)內(nèi)脂類抗生素耐藥表型(D試驗)的檢測。D試驗陽性13株，陽性率52%，即表現(xiàn)為克林霉素誘導(dǎo)性耐藥表型13.1%；余下12株菌為D試驗陰性，即MS型12.1%。

2.2CAMP陰性GBS菌株的菌落形態(tài)、生化試驗、耐藥性及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥表型結(jié)果118株GBS中1株為CAMP試驗陰性，全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定為GBS，將該菌命名為GZ2058。該菌在血瓊脂平板上生長為灰白色半透明濕潤菌落，呈β- 溶血，革蘭染色為陽性球菌，觸酶試驗為陰性，CAMP試驗靠近指示菌株(ATCC25923)的一端未見“傘狀”溶血區(qū)域；該菌的藥敏試驗結(jié)果為：對青霉素、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、利奈唑胺、萬古霉素表現(xiàn)為敏感；對氯霉素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星表現(xiàn)為耐藥。該菌的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥表型為cMLS型。

2.3CAMP陰性GBS菌株16SrDNA序列分析及cfb基因檢測GZ2058菌株的16SrDNA序列提交到GenBank，獲得登陸號：MG386601在線比對分析與無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)同源性為100%。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示GZ2058與無乳鏈球菌聚為一類，見圖1。GZ2058的cfb基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后成像可見大小約為260 bp的目的條帶，見圖2。BLAST分析結(jié)果顯示，擴(kuò)增序列與無乳鏈球菌的cfb基因同源性為100%。

圖1　GZ2058 16SrDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2　CAMP陰性的無乳鏈球菌(GZ2058)cfb基因的檢測結(jié)果

3　討論

1887年無乳鏈球菌第一次被報道在牛乳腺炎中分離得到，50年后第一次發(fā)現(xiàn)無乳鏈球菌可引起嚴(yán)重的新生兒感染。隨后人們對無乳鏈球菌進(jìn)行了大量的研究證實：無乳鏈球菌感染的孕婦可發(fā)生早產(chǎn)、胎膜早破、晚期流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局，同時孕婦在分娩的過程中可感染新生兒發(fā)生早發(fā)型或晚發(fā)型新生兒感染性疾病。其致病機(jī)制主要是通過分泌各種黏附因子(如層黏蛋白結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、絲氨酸重復(fù)蛋白、免疫原性細(xì)菌黏附蛋白、αC蛋白等)黏附于宿主細(xì)胞表面侵入細(xì)胞內(nèi)分泌各種毒力因子(如CAMP因子、細(xì)胞溶血素、莢膜多糖等)而致病[7]。本研究收集了3 794例孕晚期婦女生殖道分泌物樣本，共培養(yǎng)出118株無乳鏈球菌，分離率約3.11%，低于楊淋等[8～11]報道的貴州省銅仁地區(qū)孕婦的帶菌率10.7%[8]，深圳地區(qū)12.0%，福建地區(qū)19.7%，廣州地區(qū)6.33%。國外研究顯示在肯尼亞、南非GBS在孕婦生殖道中的攜帶率為14.3%～10%[12]；在歐洲孕婦生殖道標(biāo)本GBS攜帶率為6.5%～36%[13]。這可能與無乳鏈球菌在孕婦生殖道定植的地區(qū)、民族差異等有關(guān)。此外，不同的篩查方法結(jié)果不同：采用肉湯增菌、GBS顯色培養(yǎng)基、PCR檢測可以提高GBS檢出率，但相對費(fèi)用較高，且PCR方法也不能100%檢出GBS，也存在假陰性結(jié)果[14]。本研究對無乳鏈球菌的培養(yǎng)篩查的方法使用血平板直接接種樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，樣本采集方法及轉(zhuǎn)運(yùn)過程對培養(yǎng)的結(jié)果會有一定的影響，可能會導(dǎo)致分離率降低。

本研究中檢出1例CAMP陰性的無乳鏈球菌，在血瓊脂平板上該菌為灰白色、濕潤半透明菌落，有狹窄β- 溶血環(huán)，這與臨床實驗室常見的無乳鏈球菌的菌落形態(tài)十分相似，但該菌CAMP試驗為陰性，經(jīng)16SrDAN序列分析證實該菌與無乳鏈球菌同源性為100%。目前國內(nèi)尚無研究報道發(fā)現(xiàn)人源性CAMP陰性的無乳鏈球菌，此為首例，僅見一例分離自羅非魚中的γ- 溶血的無乳鏈球菌的相關(guān)報道[5]。CAMP因子是一種具有穿孔性能的分泌性蛋白，可與人類的IgG，IgM的Fc段結(jié)合啟動免疫應(yīng)答反應(yīng)而被認(rèn)為是無乳鏈球菌的毒力因子之一。在活體動物試驗中已經(jīng)證實：純化的CAMP因子可導(dǎo)致兔子及小鼠死亡[15，16]，但Mary 等[17]人通過對CAMP因子編碼基因cfb進(jìn)行等位基因替換后的體外及體內(nèi)試驗研究認(rèn)為CAMP因子在GBS的毒力系統(tǒng)中不是必須的。1944年Christie等人第一次報道，認(rèn)為CAMP因子對無乳鏈球菌有很高的特異性，可與金黃色葡萄球菌的神經(jīng)鞘磷脂酶產(chǎn)生協(xié)同作用，可形成傘狀的透明溶血區(qū)域，稱為CAMP試驗陽性，此后廣泛的被臨床實驗室用作無乳鏈球菌的重要鑒定試驗。1979年CAMP因子由Bernheimer等人分離純化。1994年其編碼基因cfb被人們發(fā)現(xiàn)。后續(xù)的研究顯示幾乎所有的無乳鏈球菌都含有編碼CAMP因子的編碼基因cfb，但仍有研究報道顯示確實存在CAMP陰性的表現(xiàn)型無乳鏈球菌[18]，且目前認(rèn)為絕大多數(shù)(>98%)的無乳鏈球菌都含有CAMP的編碼基因cfb基因，CAMP陰性的菌株可能與cfb基因的突變有關(guān)[19]。本研究中GZ2058經(jīng)檢測其基因組中含有cfb基因，這與Hassan等[18]人的報道一致。近年來國外研究證實無乳鏈球菌含有21個雙信號傳導(dǎo)系統(tǒng)(two- component signal transduction system，TCS)，主要參與無乳鏈球菌的新陳代謝及毒力因子的表達(dá)調(diào)控，其中CovR/S是無乳鏈球菌中重要的毒力因子相關(guān)基因的調(diào)控元件，包括CAMP因子編碼基因cfb及細(xì)胞溶血素的編碼基因cylE等，在CovR/S突變的GBS菌株，特別是CovR缺失的菌株中可看到GBS的β- 溶血素及各黏附素的活力增加，但CAMP因子的活性下降的現(xiàn)象[20，21]，因此GZ2058有可能是由于CovS/CovR的突變導(dǎo)致的CAMP陰性的菌株，但也不排除是由于cfb基因突變導(dǎo)致的CAMP陰性的可能。本研究中人源性CAMP陰性的無乳鏈球菌的檢出給臨床微生物檢驗工作一個警示，CAMP試驗對于無乳鏈球菌的鑒定不是100%，CAMP陰性的無乳鏈球菌可在孕婦的生殖道定植，在臨床檢驗的工作中仍然需要從多方面去完善其鑒定流程，避免漏檢。

2010年美國CDC推薦將青霉素作為GBS陽性孕婦的首選用藥，在分娩前每4 h靜脈滴注1次直至生產(chǎn)，予以預(yù)防經(jīng)產(chǎn)道分娩的新生兒發(fā)生GBS感染，對青霉素過敏的孕婦，推薦使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素和林克酰胺類抗生素克林霉素，并且應(yīng)加做D試驗檢測紅霉素對克林霉素誘導(dǎo)的誘導(dǎo)性耐藥的菌株。隨著抗生素濫用，細(xì)菌對某些藥物呈現(xiàn)高度耐藥的情況在本研究中的118株無乳鏈球菌中也得到證實。其中耐藥率最高的藥物為紅霉素(82.2%)，其余依次為左氧氟沙星(72.9%)、克林霉素(62.7%)，耐藥率均高于全國其他地區(qū)[8，10，11，22]。此外，近年日本有研究報道發(fā)現(xiàn)了青霉素敏感度降低的GBS菌株，并且此類菌株的檢出率從2006年的2.3%上升到2013年的14.7%[23]。在國內(nèi)，僅見北京地區(qū)和廣州地區(qū)有報道分離出了對青霉素和氨芐西林呈現(xiàn)中度敏感的菌株，并且檢出率為17.0%[24]。但在本研究中未發(fā)現(xiàn)青霉素耐藥或者敏感性降低的菌株，對此青霉素仍然可作為本地區(qū)預(yù)防及治療新生兒GBS感染的首選用藥。iMLS表型表現(xiàn)為對紅霉素耐藥，對克林霉素敏感或中介，且儀器檢測的藥敏結(jié)果無法判斷紅霉素和克林霉素之間的誘導(dǎo)性耐藥關(guān)系，本研究中D試驗陽性率為52%，高于周燕珍等[25]人的報道，這可能與無乳鏈球菌的血清型、表面蛋白、耐藥基因及地域分布的差異有密切的關(guān)系。為避免臨床不合理用藥的發(fā)生，臨床實驗室應(yīng)常規(guī)進(jìn)行D試驗，對D試驗陽性，克林霉素檢測結(jié)果為敏感的菌株將報告修正為耐藥，以正確指導(dǎo)臨床合理用藥。

綜上所述，目前國內(nèi)無乳鏈球菌對孕婦及新生兒的健康威害日益被重視，孕晚期婦女生殖道無乳鏈球菌定植的篩查應(yīng)納入孕婦產(chǎn)前檢查的常規(guī)檢查項目，并且在有條件的地區(qū)應(yīng)優(yōu)化檢驗流程及檢驗方法提高檢出率，雖然CAMP陰性的GBS菌株極為少見，并且此類菌株相關(guān)的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)較少，關(guān)于其表現(xiàn)為CAMP陰性的具體原因及在臨床感染中的致病性也尚不明確，但仍然建議臨床實驗室在日常的微生物檢驗工作中格外留意，避免此類菌株的漏檢。同時加強(qiáng)對GBS耐藥菌株的耐藥監(jiān)測及管理。

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由于外界溫度過高以及長時間接受暴曬，牛羊極易出現(xiàn)日射病，并有可能引發(fā)光照性皮炎；同時，由于外界環(huán)境的濕度以及溫度過高，極易導(dǎo)致牛羊患熱射?。辉诖髿鉁囟茸兓^為明顯時，例如突然升高或者突然降低，可能會導(dǎo)致牛羊患呼吸道疾病或者感冒等；基于地表泥濘、降水多等的影響，夏季牛羊患腐蹄癥的可能性也較高。

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