響應(yīng)面法優(yōu)化蛋殼內(nèi)膜酶解制備抑菌活性物質(zhì)的工藝條件

牛明福，杜夢(mèng)璇，張婷婷，李亞恒，宮 強(qiáng)，秦翠麗，侯 穎，李 陽(yáng)

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物資源開(kāi)發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng)471023）

蛋殼由蛋外殼與蛋殼內(nèi)膜兩部分組成，兩者都具有多種有效成分（何柳，2012），是豐富的鈣資源和蛋白資源，可作為食品、飼料、化學(xué)、輕工、醫(yī)藥等相關(guān)行業(yè)的寶貴原材料 （白鑫華，2017；Preetam和Somenath，2016；Eletta，2016）。 蛋外殼主要成分為碳酸鈣，蛋殼內(nèi)膜的主要成分是蛋白質(zhì)，類似細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的組成，以糖蛋白的形式存在，蛋殼膜約含90%蛋白質(zhì) （角蛋白、膠原蛋白、復(fù)合蛋白等）（Mohammadi，2016；劉焱，2014；周艷華，2010）。 研究表明，蛋殼膜中膠原蛋白可代替食品中動(dòng)物膠原蛋白（任萌，2012；Zhao，2009；Long，2004），所以蛋殼膜應(yīng)用于食品、化妝品或其他行業(yè)的潛力巨大，也是多肽或氨基酸的極好來(lái)源（Shi，2104)。

多肽的制備途徑和方法有很多，酶解法反應(yīng)速度快、條件溫和、氨基酸不會(huì)被破壞，構(gòu)型不會(huì)發(fā)生改變，操作易于控制，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，而且能夠保證多肽的天然活性（Sarbjeet，2015；汪寶歡，2009；張嫻，2007）。本試驗(yàn)首先用不同的蛋白酶酶解蛋殼內(nèi)膜制備蛋膜酶解液，檢測(cè)其抑菌活性，為了得到更好的試驗(yàn)效果和最優(yōu)的酶解工藝條件，進(jìn)一步應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法（RSM）（Reza，2016；劉瓊，2016；李莉，2013），以蛋殼內(nèi)膜酶解液對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌（S.enteritidis）的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳酶解工藝條件，同時(shí)對(duì)蛋殼內(nèi)膜的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 雞蛋殼采自學(xué)校蛋糕房；堿性蛋白酶（≥200 U/mg）、中性蛋白酶（≥60 U/mg）、胰蛋白酶（4 ～ 6 U/mg）、木瓜蛋白酶（0.5 ～ 2 U/mg）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；抗生素對(duì)照品恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；雞大腸埃希氏菌（Chicken E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）、雞腸炎沙門(mén)氏菌（S.enteritidis）、痢疾志賀氏菌（S.dysenteriae）、嗜水汽單胞菌（A.hydrophila）、產(chǎn)腸毒大腸埃希氏菌（Enterotoxigenic E.coli）、禽多殺性巴氏桿菌（P.multocida）為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1蛋殼內(nèi)膜粉的制備 新鮮雞蛋殼 （清洗蛋殼上污物及殘余蛋清）→手剝蛋殼得蛋殼內(nèi)膜→置70℃烘箱6 h→粉碎機(jī)粉碎 （80目篩）→蛋殼內(nèi)膜粉，于干燥瓶中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2酶解液的制備 取一定量的蛋殼內(nèi)膜粉加入PBS溶液中，添加適量的NaOH，90℃水浴20 min，冷卻至室溫，調(diào)整pH，加入適量蛋白酶，在適當(dāng)溫度下酶解數(shù)小時(shí)，并維持酶解液pH基本不變，反應(yīng)完畢后于90℃水浴10 min進(jìn)行滅酶處理。滅酶后的酶解液12000 r/min離心10 min，上清用0.45 μm濾膜過(guò)濾得粗酶解液（史雅凝，2015）。

1.2.3蛋白酶的篩選 蛋殼膜中主要是膠原蛋白、角蛋白等硬性蛋白，難溶于水，預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋殼內(nèi)膜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，通過(guò)NaOH處理完后溶液呈透明狀，黏度較小，較適合于后續(xù)的酶解試驗(yàn)，因此后面的酶解試驗(yàn)均使用NaOH預(yù)處理的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的蛋殼內(nèi)膜。稱取等量的蛋殼內(nèi)膜粉分別置于4個(gè)錐形瓶中，NaOH預(yù)處理后，在不同蛋白酶各自最適溫度和pH條件下（具體酶解條件見(jiàn)表1），分別添加同等量的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解4 h，90 ℃滅酶10 min，12000 r/min離心10 min，上清用0.45 μm濾膜過(guò)濾得各酶解液，采用牛津杯法（佘之蘊(yùn)等，2016）測(cè)定各種蛋白酶酶解液的抑菌活性，選擇酶解效果最好的蛋白酶。

表1　各種蛋白酶的酶解條件

1.2.4單因素試驗(yàn) 參照李鑫（2013）的方法并加以改進(jìn)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以2%蛋殼內(nèi)膜為底物，選擇NaOH添加量、酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間及酶解pH五因素，各因素梯度見(jiàn)表2，以對(duì)S.enteritidis的抑菌效果為指標(biāo)，篩選較合適的酶解條件范圍。

表2　酶解條件的單因素試驗(yàn)

1.2.5響應(yīng)面分析因素及水平的確定 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑Y(jié)為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)法對(duì)酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、酶用量（C）、pH（D）設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化分析（表 3）（楊瑩瑩等，2012；黎元生，1996）。

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.2.6蛋殼內(nèi)膜酶解液抑菌活性成分的初步確定將蛋殼內(nèi)膜堿性蛋白酶酶解液12000 r/min離心10 min，取上清0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液加入2倍體積無(wú)水乙醇沉淀過(guò)夜，12000 r/min離心10 min，上清蒸發(fā)除去乙醇（標(biāo)記為①），沉淀用水溶解，加入等體積10%TCA溶液，再靜置2 h，12000 r/min離心10 min，離心后的上清液即為含多糖的溶液（標(biāo)記為②），沉淀用適量PBS溶液溶解后即為含多肽的溶液(標(biāo)記為③），仍采用牛津杯法，恩諾沙星(ENR)做陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)樣品①、②、③對(duì)S.enteritidis的抑菌活性（胡徐登等，2015）。

1.3數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，并表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用 Origin7.5軟件繪制曲線圖；響應(yīng)面試驗(yàn)采用 Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析，并優(yōu)化出最佳提取工藝。

2　試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1蛋殼內(nèi)膜酶解的單酶篩選 由表4可知，堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解液對(duì)禽大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、嗜水氣單胞菌、產(chǎn)腸毒大腸埃

表4　不同酶解液的抑菌結(jié)果

希氏菌和禽多殺性巴氏桿菌均有抑菌效果，木瓜蛋白酶酶解液對(duì)產(chǎn)腸毒大腸埃希氏菌和禽多殺性巴氏桿菌沒(méi)有抑菌效果，胰蛋白酶解液對(duì)所有菌都沒(méi)有抑菌效果，這可能是不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同，所得酶解液中的成分也不同所致。不同蛋白酶酶解液對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抑菌效果比其他幾種菌都好，基于上述抑菌試驗(yàn)結(jié)果，以對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，選用堿性蛋白酶進(jìn)行單因素試驗(yàn)及優(yōu)化試驗(yàn)，以獲得具有最好抑菌活性的蛋殼內(nèi)膜酶解液。

2.2酶解單因素試驗(yàn) 由圖1可以看出NaOH濃度為4%時(shí)酶解液的抑菌圈直徑最大；溫度為30～45℃時(shí)，隨著溫度的升高，抑菌圈直徑呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)；當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí)，抑菌圈直徑幾乎是最大值；當(dāng)溫度為50℃后，抑菌圈直徑明顯變小，說(shuō)明溫度可能會(huì)影響堿性蛋白酶的活性，酶解溫度為40℃和45℃時(shí)的抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)酶解時(shí)間為1～3 h，抑菌圈直徑趨于增大，抑菌效果有明顯提高，3 h后抑菌圈直徑趨于平穩(wěn)，變化不明顯，4 h和5 h的抑菌圈直徑與3 h的差異不顯著（P＞0.05）。隨著加酶量的逐漸加大，酶解液抑菌圈直徑逐漸增大，超過(guò)40 U/mg后不再增大，50 U/mg與40 U/mg加酶量的抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05）。抑菌圈直徑隨pH的增大先上升后下降，pH是影響蛋白酶活性的重要因素，當(dāng)pH低于10時(shí)，可能未達(dá)到堿性蛋白酶的最佳催化效果，而當(dāng)pH超過(guò)10時(shí)，又會(huì)影響蛋白酶自身的結(jié)構(gòu)和活性，使酶的催化能力受到一定程度的抑制，pH 9和pH 11的抑菌圈直徑與pH 10的差異顯著 （p＜0.05）。綜上可知，單因素酶解的較適條件為：NaOH 4%，酶解溫度45℃，酶解時(shí)間3 h，加酶量 40 U/mg，pH 10。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 利用Design Expert 8.0.6分析軟件，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)法及響應(yīng)面分析法，探討A-酶解溫度、B-酶解時(shí)間、C-酶用量、D-pH及其交互作用對(duì)雞蛋殼內(nèi)膜蛋白酶酶解液抑菌效果的影響。21個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，試驗(yàn)號(hào) 2、4、7、14、21 是中心試驗(yàn)點(diǎn)（零點(diǎn)），其中析因點(diǎn)為自變量取值在 A、B、C、D所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析如表5所示，響應(yīng)面數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

2.3.2響應(yīng)面模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)表5試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到的模擬回歸方程，如下所示：

響應(yīng)面的回歸顯著性方差分析見(jiàn)表5。

由表6可知，該回歸二次方程模型具有顯著差異性（p＜ 0.05）， R2=0.9275，模型相關(guān)度很好，說(shuō)明該模型是顯著的、擬合情況良好、可靠性較高。失擬項(xiàng)P值0.0543＞0.05，不顯著，表明試驗(yàn)誤差較小，失擬度好，一些未知因素對(duì)試驗(yàn)干擾少，這進(jìn)一步說(shuō)明各因素值和響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用Quadratic模型來(lái)函數(shù)化。模型的信噪比為7.499＞4，表明選用的響應(yīng)面模型合理。當(dāng)顯著水平小于0.05時(shí)，它所對(duì)應(yīng)的單個(gè)條件對(duì)響應(yīng)值的作用是顯著的。分析結(jié)果表明，因素一次項(xiàng)以及二次項(xiàng)A、B、C、C2、D2對(duì)酶解液抑菌效果有顯著影響 （P ＜0.05），交互項(xiàng) BC（P=0.0135＜0.05）、BD（P=0.0181＜0.05）、CD（P=0.0034＜0.05）差異顯著，表明酶解時(shí)

間、酶用量、酶解pH對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液的抑菌效應(yīng)顯著，并且它們之間存在交互作用。由回歸方程可知，各因素對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液的抑菌效果影響的方程系數(shù)為 A-酶解溫度 （0.69）、B-酶解時(shí)間（0.97）、C-酶用量（0.92）、D-pH（0.39），影響因素的主次順序?yàn)槊附鈺r(shí)間＞酶用量＞酶解溫度＞pH。

表5　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

表6　回歸模型方差分析

2.3.3響應(yīng)面交互作用結(jié)果分析 采用軟件Design Expert 8.0.6分析軟件做兩兩因素交互作用的響應(yīng)曲面及等高線，確定酶解時(shí)間、酶用量、酶解溫度、酶解pH對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液抑菌效果的影響，經(jīng)回歸模型方差分析結(jié)果可知，交互項(xiàng)AB、AC、AD的P值均大于0.05，差異不顯著，交互項(xiàng)BC（P=0.0135＜0.05）、BD（P=0.0181＜0.05）、CD（P=0.0034＜0.05）差異顯著，所選試驗(yàn)因素與響應(yīng)面之間的具有顯著作用的交互項(xiàng)，通過(guò)繪制響應(yīng)面曲線圖及等高線進(jìn)行可視分析，結(jié)果如圖2、3、4 所示。

圖2　酶解時(shí)間和酶用量交互作用對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液抑菌效果影響的響應(yīng)曲面及等高線

圖3　酶解時(shí)間和pH交互作用對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液抑菌效果影響的響應(yīng)曲面及等高線

圖4 pH和酶用量交互作用對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液抑菌效果影響的響應(yīng)曲面及等高線

圖2、3、4表明酶解時(shí)間、酶用量、pH中任意一個(gè)變量取零水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對(duì)蛋膜酶解液抑菌效果的影響。一個(gè)響應(yīng)曲面圖的坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于這種處理?xiàng)l件下的改變?cè)矫舾校f(shuō)明這兩種自變量的交互作用比較強(qiáng)。從圖中可以看出酶用量與酶解pH的交互作用，以及酶解時(shí)間與酶用量的交互作用比酶解時(shí)間與酶解pH的交互作用要大。等高線圖的形狀反映出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示2個(gè)因素作用顯著，圓形則相反，圖 2、3、4等高線曲率較小，說(shuō)明交互項(xiàng)CD，BC，BD的影響較顯著，當(dāng)酶用量一定時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)抑菌圈直徑增大，當(dāng)酶解到一定時(shí)間后，抑菌效果幾乎不變，甚至有減小趨勢(shì)，說(shuō)明酶解時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，否則既浪費(fèi)資源，抑菌效果也不理想；當(dāng)pH一定時(shí)，抑菌效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)先增強(qiáng)后減弱；且當(dāng)pH一定時(shí)，抑菌效果隨酶用量的增多而增強(qiáng)，達(dá)到一定濃度后抑菌效果不再變化。

2.3.4蛋膜酶解液最佳抑菌效果的酶解條件驗(yàn)證試驗(yàn) 應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解工藝，經(jīng)曲面擬合后，得到的最佳酶解條件為：酶解溫度45℃，酶解時(shí)間2 h，酶用量37.51 U/mg，pH為10.14，此時(shí)預(yù)期的酶解液對(duì)S.enteritidis的抑菌圈直徑是（17.941±0.21）mm。為了檢測(cè)預(yù)測(cè)結(jié)果是否與真實(shí)情況相一致，以曲面擬合的最佳條件為試驗(yàn)條件進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果得到的抑菌圈直徑平均值為（17.927±0.19）mm，高于優(yōu)化前任一條件下的數(shù)據(jù)，且與預(yù)期的試驗(yàn)最大值接近。因此，在該工藝條件下試驗(yàn)結(jié)果比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好，同時(shí)也證明響應(yīng)面分析的可靠性，說(shuō)明按照數(shù)學(xué)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)是可行的。

2.4蛋殼內(nèi)膜酶解液抑菌活性成分的初步確定以對(duì)S.enteritidis的抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，測(cè)酶解液不同成分的抑菌活性，最終結(jié)果抑菌圈直徑大小分別為：①：0 mm，②：0 mm，③：（14.02 ±0.36）mm，恩諾沙星陽(yáng)性對(duì)照（15.96 ±0.48）mm，從抑菌效果可以看出蛋殼內(nèi)膜酶解液中發(fā)揮抑菌作用的成分為蛋白酶解后的蛋白或多肽，而非蛋殼內(nèi)膜酶解液中的多糖成分或其他成分，這與充分利用蛋殼膜中豐富的蛋白質(zhì)成分的試驗(yàn)初衷相符，也為進(jìn)一步探討蛋殼膜酶解液的抑菌多肽成分奠定了基礎(chǔ)。

3　結(jié)論

3.1試驗(yàn)測(cè)定了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶4種蛋白酶對(duì)雞蛋殼內(nèi)膜酶解后的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解液對(duì)幾種測(cè)試菌的抑菌效果較好。

3.2對(duì)堿性蛋白酶的酶解條件進(jìn)行了單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化，通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)并同時(shí)建立回歸模型，經(jīng)驗(yàn)證得到的回歸擬合程度較好 （R2=0.9275）。從模型中看出，酶解時(shí)間、酶用量、酶解pH對(duì)蛋殼內(nèi)膜酶解液的抑菌效果影響顯著，各因素之間存在交互作用。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，確定蛋殼內(nèi)膜酶解液抑菌效果最佳工藝酶解條件為酶解溫度45℃，酶解時(shí)間2 h，酶用量37.51 U/mg，酶解pH 10.14。

3.3在獲得的最佳酶解條件下，試驗(yàn)驗(yàn)證所得蛋殼內(nèi)膜酶解液對(duì)S.enteritidis的抑菌圈直徑為（17.927±0.19）mm，與理論最優(yōu)值（17.941±0.21） mm接近，抑菌效果比優(yōu)化前提高了10.52%。

3.4酶解液初步處理說(shuō)明發(fā)揮抑菌活性的成分為蛋白或多肽，證明了試驗(yàn)的可行性，后續(xù)將進(jìn)一步研究抑菌活性成分及其他生物活性。

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