MMP-9和TIMP-1在豐宮并殖吸蟲感染大鼠致肺纖維化中的表達(dá)及意義

李 芳

運(yùn)城護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山西運(yùn)城 043100

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是由慢性炎癥性組織損傷和修復(fù)共同作用的結(jié)果，病變主要累及肺間質(zhì)，也可累及肺泡上皮細(xì)胞和肺血管，以大量成纖維細(xì)胞聚集和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積為特點(diǎn)，并最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難、咳嗽、呼吸生理機(jī)能受限及氣體交換障礙等癥狀[1-4]。近年來，肺纖維化的發(fā)病率、病死率呈上升趨勢[5]。引起肺纖維化的病因有多種，如粉塵、病毒、細(xì)菌、寄生蟲、藥物、放射性損傷等。不同病因所致肺纖維化改變都從肺泡炎開始，在發(fā)展和修復(fù)過程中導(dǎo)致肺纖維化[6]。

各種原因引起的肺纖維化形成的過程中，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的代謝異常都是相似的。而MMPS是分解ECM的主要酶類，MMP-9作為MMPS家族較重要的成員之一，可以降解分布于肺基底膜和間質(zhì)的膠原等ECM成分，進(jìn)而影響肺纖維的發(fā)生，TIMP-1則可特異性抑制MMP-9的活性。正常情況下，在體內(nèi)兩者之間存在著一種動態(tài)平衡來維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。兩者的失衡被認(rèn)為在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

近年來多項(xiàng)關(guān)于各種因素所致的動物或人肺纖維化的實(shí)驗(yàn)都表明，在肺纖維化早期MMP-9表達(dá)升高，破壞了肺泡壁的ECM成分，為成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞移行創(chuàng)造條件而觸發(fā)肺纖維化；在疾病后期，TIMP-1表達(dá)相對增多，抑制了ECM的降解，調(diào)節(jié)肺組織重塑。但是有關(guān)MMP-9和 TIMP-1在豐宮并殖吸蟲所致的肺纖維化中的表達(dá)的文獻(xiàn)未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立豐宮并殖吸蟲感染大鼠肺纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察受損肺臟的的病理學(xué)特征及MMP-9和TIMP-1表達(dá)情況，從而了解MMP-9和TIMP-1在豐宮并殖吸蟲致大鼠肺纖維化中的作用，有助于為其治療及預(yù)后提供新途徑和方法。

1　材料與方法

1.1　材料

豐宮并殖吸蟲后尾蚴在云南省景洪市豐宮并殖吸蟲流行區(qū)采集溪蟹，常規(guī)分離豐宮并殖吸蟲后尾蚴。主要儀器：圖像分析系統(tǒng)購自日本尼康公司。Rat MMP-9、TIMP-1 Elisa kit購自上海拜力生物科技有限公司；試劑：Masson染色試劑盒購自上海杰美基因科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物 分組SD大鼠，正常對照組5只，感染組為20只。實(shí)驗(yàn)感染組每鼠腹腔注射豐宮并殖吸蟲后尾蚴8條。對照組大鼠注射等量的蒸餾水即可。感染組按感染時(shí)間的長短分為4組即感染3周組，感染5周組，感染7周組，感染9周組。

1.2.2大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)水平檢測 免疫組化染色檢測肺臟MMP-9和TIMP-1的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)是用抗體（兔抗MMP-9 ，TIMP-1多克隆抗體）追蹤抗原（MMP-9 ，TIMP-1）。每張切片在高倍鏡下400倍下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，其陽性細(xì)胞呈棕黃或棕褐色。利用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，測定陽性細(xì)胞的平均光密度用平均光密度代表相應(yīng)蛋白即MMP-9 TIMP-1蛋白表達(dá)量的多少。

1.2.3ELISA法檢測大鼠血清中MMP-9、TIMP-1含量 剖殺動物取血于抗凝管中，離心得血清。按Rat MMP-9、TIMP-1 Elisa kit的操作步驟進(jìn)行測定。

1.3　肺組織病理學(xué)評分

剖殺動物取得肺組織制作石蠟切片，并行HE、Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)Szapiel等[7]方法評價(jià)肺泡炎癥和肺纖維化程度。將等級資料轉(zhuǎn)化為計(jì)量資料，即0級為0分，Ⅰ級為1分，Ⅱ級為2分，Ⅲ級為3分。肺泡炎分為4級：0級，無肺泡炎；Ⅰ級：輕度肺泡炎，病變范圍占全肺的20%以下，肺泡結(jié)構(gòu)完整；Ⅱ級：中度肺泡炎，病變范圍占全肺的20%～50%；Ⅲ級：重度肺泡炎，受累面積＞50%。肺間質(zhì)纖維化也分為4級：0級，無纖維化；Ⅰ級：輕度纖維化，受累范圍＜20%；Ⅱ級：病變范圍占全肺的20%～50%；Ⅲ級：彌漫性肺纖維化，病變范圍超過全肺的50%。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，如資料服從正態(tài)分布，則用（x±s）表示；如資料呈偏態(tài)分布，則用（M±Q）表示。對服從正態(tài)分布的多組計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，用SNK法（q-test）或最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)進(jìn)一步行兩兩比較，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對于不服從正態(tài)分布的資料或雖然是正態(tài)分布資料但經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后認(rèn)為方差不齊時(shí)，用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多樣本資料的秩和檢驗(yàn)即H檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)（調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)α'=α/總比較次數(shù)10次，即α'=0.005），以此作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)看兩兩之間是否有差異。

2　結(jié)果

2.1　肺組織光學(xué)顯微鏡病理形態(tài)學(xué)變化

光鏡下觀察，對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，肺泡隔無增寬，支氣管腔及肺泡強(qiáng)內(nèi)未見炎性滲出物，無肺泡炎改變，支氣管壁，血管壁可見少許膠原組織（圖1～2）；感染組第3周肺泡壁稍增厚，局部輕度充血，水腫及少許炎癥細(xì)胞浸潤（圖3～4）；感染組第5周肺泡炎最顯著，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡隔充血，水腫及大量炎細(xì)胞浸潤，致其明顯增厚（圖5～6）；感染組第7周肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡融合，肺泡隔嚴(yán)重充血，水腫及炎細(xì)胞浸潤，可見支氣管上皮脫落（圖7～8）；感染組第9周肺泡結(jié)構(gòu)破壞，有肺大泡形成，局部肺實(shí)變，實(shí)變周圍有肺氣腫，纖維增生形成結(jié)節(jié)狀，仍有中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤（圖9～10），Masson染色可見被染成藍(lán)色的膠原纖維。

圖1　正常對照組大鼠肺組織切片（HE×40）；

圖2　正常對照組大鼠肺組織切片（Masson×20）

圖3　感染第3周肺組織病理切片（HE×40）；

圖4　感染第3周肺組織病理切片（Masson×20）

圖5　感染第5周肺組織病理切片（HE×40）；

圖6　感染第5周肺組織病理切片（Masson×20）

圖7　感染第7周肺組織病理切片（HE×40）；

圖8　感染第7周肺組織病理切片（Masson×20）

圖9　感染第9周肺組織病理切片（HE×40）；

圖10　感染第9周肺組織病理切片（Masson×20）

2.2　肺組織病理學(xué)評分

綜合HE染色及Masson染色的鏡下表現(xiàn)，按照Szapiel等[7]方法評價(jià)肺泡炎癥和肺纖維化程度。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：除感染7周組和感染9周組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余任何兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肺纖維化評分，除感染5周組和感染7周組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余任何兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖 11 ～ 12。

圖11　各組肺泡炎程度評分比較

圖12　各組肺纖維化程度評分比較

2.3　免疫組化結(jié)果

TIMP-1除感染3周組和感染5周組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）MMP-9、TIMP-1正常對照組、感染7周組和感染9周組、MMP-9/TIMP-1任何兩個(gè)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　各組大鼠肺組織內(nèi)MMP-9及TIMP-1蛋白水平表達(dá)及兩者的比值（±s ）

表1　各組大鼠肺組織內(nèi)MMP-9及TIMP-1蛋白水平表達(dá)及兩者的比值（±s ）

組別　MMP-9　TIMP-1　MMP-9/TIMP-1正常對照組　0.47±0.02　0.45±0.01　1.04±0.01感染3周組　0.55±0.02　0.48±0.01　1.15±0.02感染5周組　0.70±0.04　0.49±0.01　1.43±0.04感染7周組　0.51±0.03　0.66±0.01　0.77±0.02感染9周組　0.49±0.01　0.88±0.01　0.56±0.01

2.4　ELISA法檢測大鼠血清中MMP-9及TIMP-1含量，計(jì)算MMP-9/TIMP-1的比值

MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1，任何兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　各組大鼠血清中MMP-9及TIMP-1含量及兩者的比較（±s ）

表2　各組大鼠血清中MMP-9及TIMP-1含量及兩者的比較（±s ）

組別　MMP-9　TIMP-1　MMP-9/TIMP-1正常對照組　93.71±8.05　3.58±0.04　26.18±0.37感染3周組　137.07±20.10　3.77±0.02　36.46±0.59感染5周組　104.80±1.20　4.04±0.02　25.82±0.12感染7周組　99.64±8.02　4.37±0.01　22.92±0.20感染9周組　95.00±2.43　4.90±0.10　19.78±1.15

3　討論

肺纖維化是一類以彌漫性的肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂并最終以瘢痕組織取代正常肺組織為特征的疾病。其發(fā)生包括早期的肺泡炎階段和后期的肺纖維化階段。近年的研究發(fā)現(xiàn)MMPS與肺纖維化密切相關(guān)[8]。各種肺纖維化的共同病理為細(xì)胞外基質(zhì)的代謝紊亂。而MMPS是上世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一類分解ECM的主要酶類，MMP-9作為MMPS家族較重要的成員之一，可以降解分布于肺基底膜和間質(zhì)的膠原等ECM成分，導(dǎo)致肺損傷進(jìn)而啟動肺纖維的發(fā)生，TIMP-1則可特異性抑制MMP-9的活性，從而參與細(xì)胞外基質(zhì)的代謝。

近年來，有關(guān)MMP-9及TIMP-1在肺纖維化中表達(dá)變化的研究逐漸增多，學(xué)者們從實(shí)驗(yàn)或臨床方面研究這兩個(gè)因子與不同類型肺纖維化的關(guān)系，有人使用博來霉素建立小鼠肺纖維化模型來研究[9]，有人使用射線照射小鼠全肺建立放射性肺纖維化模型來研究[10]，有人建立糖尿病大鼠模型研究這兩個(gè)因子在2型糖尿病大鼠肺組織中的表達(dá)變化[11]，有人研究急性百草枯中毒大鼠肺組織中兩個(gè)因子的表達(dá)變化[12]，有人用高氧致新生大鼠肺部病變來研究[13]有人在臨床上選取一些特發(fā)性肺纖維化患者或肺結(jié)核并發(fā)纖維化患者來測定他們血清及BALF中兩個(gè)因子的水平[14-15]。但其在并殖吸蟲所致肺纖維化中的表達(dá)情況，國內(nèi)外未見報(bào)道。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們用豐宮并殖吸蟲來制造肺纖維化模型，由于豐宮并殖吸蟲是一種生物性的病因，它對肺組織既有機(jī)械性損傷又有免疫病理損傷，通過本研究證實(shí)MMP-9及TIMP-1在豐宮并殖吸蟲所致肺纖維化中的表達(dá)趨勢是否與其他因素所致肺纖維化中表達(dá)類似。此外，在本實(shí)驗(yàn)中，我們不僅通過免疫組化方法檢測MMP-9及TIMP-1在肺組織的表達(dá)水平，而且還用酶聯(lián)免疫法測定大鼠血清中MMP-9及TIMP-1含量，意在了解MMP-9及TIMP-1在機(jī)體各成份中的變化趨勢是否一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，肺組織MMP-9表達(dá)在肺損傷早期表達(dá)增多，5周時(shí)達(dá)高峰，肺組織病變以炎性損傷為主，后期有所減少。而TIMP-1在整個(gè)過程中呈現(xiàn)持續(xù)增多的趨勢，至9周時(shí)仍未下降，肺組織則逐漸出現(xiàn)纖維化病灶。MMP-9/TIMP-1比值也在5周時(shí)達(dá)最高，之后逐減少，感染9周時(shí)比值最低。同時(shí)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。并對肺泡炎及纖維化程度進(jìn)行評分，發(fā)現(xiàn)肺泡炎癥在早期較明顯，尤其在感染后5周時(shí)其炎癥最顯著，肺泡充血水腫，大量炎細(xì)胞浸潤，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，之后炎癥有所減輕，逐漸出現(xiàn)纖維化，9周時(shí)纖維化尤其明顯?？傊?，MMP-9/TIMP-1比值在感染5周時(shí)最高，炎癥最顯著，兩者比值在感染9周時(shí)最低，肺纖維化最顯著，說明免疫組化所測得肺組織MMP-9/TIMP-1比值與肺泡炎及纖維化評分是一致的。其機(jī)制可能是：蟲體首先在肺移行引起組織破壞和出血，肉眼可見點(diǎn)狀片狀充血灶，隨后，出現(xiàn)炎性滲出，滲出物中含中性和嗜酸性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等，這些炎性細(xì)胞釋放一系列細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，促進(jìn)MMPS的合成與活化，此期TIMP-1表達(dá)也增高，但相對于MMP-9不占優(yōu)勢，MMP-9/TIMP-1比值升高，該期MMP-9過度表達(dá)造成肺泡上皮細(xì)胞基底膜的破壞，炎性細(xì)胞入侵，加重早期的肺泡炎癥反應(yīng)，為后期的不恰當(dāng)修復(fù)奠定基礎(chǔ)；隨著感染時(shí)間延長，蟲體在肺部形成蟲囊，由于囊壁包裹，急性炎癥逐漸消退，MMP-9的產(chǎn)生與活化逐漸減少，但TIMP-1表達(dá)仍持續(xù)上升，引發(fā)了MMP-9/TIMP-1比例失衡，TIMP-1抑制了MMP-9對細(xì)胞基質(zhì)的降解，導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)異常沉積，積極推動了肺纖維化的形成。

本實(shí)驗(yàn)中我們還檢測了大鼠血清中MMP-9及TIMP-1含量，其變化趨勢與肺組織中免疫組化所測是相似的，只是MMP-9及MMP-9/TIMP-1比值在感染后3周便達(dá)最高峰，該高峰較上述肺組織中所測結(jié)果提前出現(xiàn)，這可能是因?yàn)檠杭胺闻菀褐醒仔约?xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等向血漿釋放MMP-9的緣故。因?yàn)榧纳x感染時(shí)，血中嗜酸性粒細(xì)胞升高明顯，一般為20%～40%，高者超過80%，而嗜酸性粒細(xì)胞是MMP-9的來源細(xì)胞之一。關(guān)于MMP-9變化趨勢是否與嗜酸性粒細(xì)胞的變化趨勢相一致，這將是之后的研究方向?？阻吹萚16]研究發(fā)現(xiàn)血清MMP-9活性高峰較肺組織MMP-9高峰提早出現(xiàn)。

總之，在肺損傷早期，MMP-9/TIMP-1比值偏高，肺組織以炎性損傷為主，后期比值偏低，TIMP-1抑制了MMP-9對膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使肺組織中膠原逐漸沉積，促進(jìn)纖維化形成。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李圣青等[9，14-15]研究結(jié)果是一致的。

本研究結(jié)果表明，在豐宮并殖吸蟲所致肺損傷中MMP-9，TIMP-1表達(dá)改變及平衡破壞參與其中，引起早期肺基底膜炎性損傷和后期肺纖維化的發(fā)生。表明兩者的失衡是豐宮并殖吸蟲致肺纖維化發(fā)生的重要基礎(chǔ)。提示我們在肺損傷的炎癥階段抑制MMP-9過度表達(dá)，在纖維化形成階段適度抑制TIMP-1活性及產(chǎn)生，是肺纖維化防治的途徑之一。

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