人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究

劉 莎 劉俊騫 鄭彥茹 宮 蕊 初麗敏 魏樹林

1.石家莊市第三醫(yī)院，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北石家莊 050031；3.石家莊市急救中心，河北石家莊 050000

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種干細(xì)胞，主要源自發(fā)育早期的中胚層，分布于臍血、脂肪以及骨髓等組織之中，既可以自我更新，也可以高度增殖，還能分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞，這種多項(xiàng)分化潛能使得間充質(zhì)干細(xì)胞成為基因治療及替代治療領(lǐng)域中有著極高實(shí)用價(jià)值的一個(gè)細(xì)胞來源[1]。然而，現(xiàn)階段間充質(zhì)干細(xì)胞的來源依然存在爭議，原因在于間充質(zhì)干細(xì)胞的經(jīng)典來源主要為骨髓組織，隨著年齡增長間充質(zhì)干細(xì)胞含量與增殖能力也會顯著下降[2]。對此，臨床嘗試將人臍帶作為來源，獲取免疫源性低且增殖能力強(qiáng)的間充質(zhì)干細(xì)胞。本研究對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及向神經(jīng)樣細(xì)胞分化進(jìn)行研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1　一般資料

選取2016年10月～2017年10月期間于本院娩出的正常新生兒，去其羊膜、血管，獲取臍帶基質(zhì)，將其剪碎為1.5mm大小的塊狀留作培養(yǎng)使用。同時(shí)，準(zhǔn)備產(chǎn)自美國N2培養(yǎng)基與DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清與谷氨酰胺、重組堿性成纖維生長因子、重組表皮生長因子、β巰基乙醇、兔康神經(jīng)微絲抗體、鼠抗β-Ⅲ類微管蛋白抗體、兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體，此外還有產(chǎn)自我國的兔抗超蛋白抗體、SABC試劑盒以及產(chǎn)自上海中西藥業(yè)的丹參注射液，產(chǎn)自日本的RT-PCR試劑盒，產(chǎn)自法國的熒光標(biāo)記小鼠抗人抗體（CD）。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用重蒸水配置兩種培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)基，在過濾消毒之后加入青霉素、鏈霉素及二性霉素B各100U/mL進(jìn)行抗菌處理，隨后在DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清與重組表皮生長因子、重組堿性成纖維生長因子各5ng/mL與谷氨酰胺，留作備用。將臍帶基質(zhì)塊放到配置好的細(xì)胞培養(yǎng)液中，于六孔板中培養(yǎng)，經(jīng)過培養(yǎng)擴(kuò)增，其呈貼壁生長，待其省占到融合時(shí)傳代使用含有抗凝劑的0.25%胰蛋白酶，在37℃下消化，3～5min后進(jìn)行離心操作，將上清去除，將細(xì)胞稀釋四五倍后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞鑒定 在細(xì)胞傳代至第3代與第8代時(shí)，分別進(jìn)行1次細(xì)胞鑒定，鑒定一起為FACScan流式細(xì)胞儀，檢查對象為細(xì)胞的表面抗原，鑒定目標(biāo)為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。

1.2.3誘導(dǎo)分化 在細(xì)胞傳代至第3代與第8代時(shí)為其誘導(dǎo)分化，待細(xì)胞貼壁生長密度達(dá)到60%時(shí)將培養(yǎng)液更換，將誘導(dǎo)劑-丹參注射液、巰基乙醇加入，其中丹參注射液的加入標(biāo)準(zhǔn)為每單位體積細(xì)胞培養(yǎng)液加入15mg/mL，4h后將培養(yǎng)液中含有的丹參吸出，以4%多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，留作早期誘導(dǎo)細(xì)胞；隨后對部分細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)，觀測其細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，在24h后吸去培養(yǎng)液中的丹參，以N2培養(yǎng)基進(jìn)行24h左右的培養(yǎng)，以4%多聚甲醛進(jìn)行固定。以巰基乙醇進(jìn)行誘導(dǎo)，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入1mmol/L的巰基乙醇，經(jīng)過24h的誘導(dǎo)將培養(yǎng)液中的巰基乙醇吸出，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，待改變明顯后繼續(xù)以N2培養(yǎng)基進(jìn)行固定，以4%多聚甲醛進(jìn)行固定。

1.2.4免疫細(xì)胞學(xué)檢查與RT-PCR檢查 使用兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體單克隆抗體、基因Neatin、兔抗神經(jīng)微絲抗體進(jìn)行誘導(dǎo)細(xì)胞的免疫組化染色，基于SABC試劑盒的相關(guān)要求進(jìn)行操作，進(jìn)行細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)記。

提取實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，使其循環(huán)得到35個(gè)，合成引物，并以1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳顯影，照相后分析結(jié)果，而半定量標(biāo)準(zhǔn)則參照β-actin[3]。

1.3　觀察指標(biāo)

觀察干細(xì)胞培養(yǎng)后的生長形態(tài)，總結(jié)其生物學(xué)特性；并且觀察間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化后的基因表達(dá)情況-臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記、造血細(xì)胞表面標(biāo)記與移植免疫排斥標(biāo)記。

2　結(jié)果

2.1　標(biāo)記表達(dá)

分離自人臍帶的貼壁細(xì)胞在體外可以生長成類似成纖維細(xì)胞的形態(tài)，在未分化狀態(tài)下可以維持穩(wěn)定增殖形態(tài)，且體外增殖遠(yuǎn)超10代。見表1 ～ 3，這類細(xì)胞表面標(biāo)記CD105、CD59、CD44、CD29有較高的表達(dá)，而造血細(xì)胞的表面標(biāo)記CD117、CD45、CD34、CD33、CD28、CD14則無表達(dá)或低表達(dá)，而與其相同表達(dá)的還有移植免疫排斥相關(guān)的表面標(biāo)記，如 CD86、CD80、CD40。

表1　臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記檢測結(jié)果

表2　造血細(xì)胞表面標(biāo)記檢測結(jié)果

表3　移植免疫排斥標(biāo)記檢測結(jié)果

2.2　誘導(dǎo)分化

經(jīng)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記β-III類神經(jīng)微管和神經(jīng)微絲、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記的膠質(zhì)纖維酸性蛋白。經(jīng)過RTPCR檢測可知，經(jīng)丹參誘導(dǎo)后的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的相關(guān)基因Neatin，而誘導(dǎo)前后間充質(zhì)干細(xì)胞全部表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞基因Pleiotrophin并且在誘導(dǎo)后表達(dá)增強(qiáng)。

3　討論

干細(xì)胞是一種具有較強(qiáng)自我更新能力且存在多種分化潛能的細(xì)胞，又被稱為祖細(xì)胞與前體細(xì)胞，其區(qū)別于其他組織細(xì)胞，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性[4]。首先，作為一種未分化細(xì)胞，干細(xì)胞不具有組織特異性，外源信號若無改變其將一直保持未分化狀態(tài)，一旦受到特定信號的影響將會分化成不同表型的成熟細(xì)胞[5]。其次，其所具備的自我更新能力可以確保其終生存在于所在器官，將其用于體外培養(yǎng)擴(kuò)增可以用于組織損傷的細(xì)胞替代治療[6]。而中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷可引發(fā)嚴(yán)重功能障礙，現(xiàn)階段臨床并無促進(jìn)神經(jīng)再生措施，引導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)修復(fù)重建的治療目標(biāo)[7]。從前文可知，間充質(zhì)干細(xì)胞的主要來源為骨髓組織，但是骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞含量并不高，每10000個(gè)骨髓單核細(xì)胞中僅有1個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞，而人臍血中雖然也存在間充質(zhì)干細(xì)胞，但是傳代培養(yǎng)困難且難以大量獲得[8]。而從相關(guān)研究可知，臍帶基質(zhì)細(xì)胞中含有的干細(xì)胞可以獲得80倍以上的體外培養(yǎng)增殖，通過各種表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)記，可證明膠帶基質(zhì)細(xì)胞能夠表達(dá)神經(jīng)標(biāo)記[9]。而通過人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，傳代后間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過3～5題可以增殖到4～5倍，及時(shí)傳代至10代其增值速度也可以保持穩(wěn)定，細(xì)胞形態(tài)呈纖維狀，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似。結(jié)合本研究結(jié)果可發(fā)現(xiàn)：間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記-CD29、CD59、CD44、CD105均為高表達(dá)，并且 CD59的表達(dá)＞90%；造血細(xì)胞表面標(biāo)記-CD45、CD34、CD33、CD14、CD117則為低表達(dá)，其第3代表達(dá)全部低于2%，而第8代表達(dá)尚不足1%；移植免疫排斥標(biāo)記-CD40、CD86、CD80的第8代表達(dá)均低于0.3%。這樣的結(jié)果表示，具有細(xì)胞高表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記具有穩(wěn)定的增殖性，其不表達(dá)移植排斥與造血細(xì)胞，表明間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種免疫缺陷細(xì)胞可以用于不同個(gè)體間的移植。同時(shí)，經(jīng)過RT-PCR檢測可知，經(jīng)丹參誘導(dǎo)后的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的相關(guān)基因Neatin，而誘導(dǎo)前后間充質(zhì)干細(xì)胞全部表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞基因Pleiotrophin并且在誘導(dǎo)后表達(dá)增強(qiáng)，這意味著經(jīng)過誘導(dǎo)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)樣細(xì)胞[10]。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有易于培養(yǎng)擴(kuò)增的生物學(xué)特性，無影響則保持穩(wěn)定，在特定影響下可分化成神經(jīng)樣細(xì)胞，這些特性使得其可以用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)治療。

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