條件培養(yǎng)基對大鼠慢性脊髓損傷后膠質(zhì)GFAP表達的影響實驗研究

張 鵬 吳翠瑩 曾 旭 劉 寧 張鵬飛 戴宜武 秦家振

解放軍陸軍總醫(yī)院，北京 100700

隨著世界各國經(jīng)濟水平的發(fā)展，交通工具與城市建設(shè)飛速發(fā)展，同時帶來脊髓損傷的發(fā)生率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢。脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是由于外界直接或間接因素導(dǎo)致脊髓損傷，在損害的相應(yīng)節(jié)段出現(xiàn)各種運動、感覺和括約肌功能障礙，肌張力異常及病理反射等的相應(yīng)改變，不僅給患者本人帶來身體和心理的嚴重傷害，還對整個社會造成巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。尤其是慢性脊髓損傷，由于其治療效果較差，備受各國研究人員的重視。

近年來，隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展，干細胞移植治療 SCI 已成為熱點，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）為來源于中胚層間充質(zhì)的成體干細胞，具有易于獲取，無倫理學(xué)爭議，增殖能力較強，易于體內(nèi)外擴增等特性，除此之外，MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)，促進神經(jīng)軸突和血管再生等作用[1-2]。然而，間充質(zhì)干細胞移植也有諸多不利：如無法長期存活、存在部位無法固定等。而間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基（BMSC-CM）因含豐富的細胞因子，對多種疾病均有積極的治療效果[3-4]。

本實驗通過觀察動物行為學(xué)并進行免疫組化學(xué)檢測得知，BMSC-CM能夠在較大程度上影響慢性脊髓損傷后膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達[5]。并對大鼠慢性脊髓損傷后的功能恢復(fù)具有重要作用，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1　一般資料

隨機選取脊髓神經(jīng)損傷研究實驗室84只雄性Wistar大鼠，兩組大鼠均為慢性脊髓損傷，依據(jù)大鼠的受傷情況并運用隨機數(shù)字表法將其分為對照組與觀察組。對照組與觀察組大鼠數(shù)量分別為42只，樣本來源于受傷后 1、4、11、21、35、60、90d 等不同時期。

1.2　方法

（1）制作慢性壓迫性脊髓損傷模型。手術(shù)前將大鼠固定在手術(shù)架上，并對其注射45mL的戊巴比妥鈉麻醉藥劑就行麻醉。以T13為中心切口，將大鼠受傷的脊髓進行切除，并將3mm長、0.5mm螺距的塑料釘嵌入大鼠的脊髓，使其脊髓受到10%的壓力，之后每隔一天便重復(fù)此操作，直至受壓程度達到40%，最大的受壓程度可達到50%。

（2）BMSCs的培養(yǎng)及BMSC-CM的收集。BMSCs的原代分離培養(yǎng)：使用2%戊巴比妥鈉（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31021725，2010-08-17，生產(chǎn)單位：上海新亞藥業(yè)有限公司）麻醉大鼠，無菌條件取股骨及脛骨，PBS清洗3次。剪掉股骨和脛骨的骨骺端，暴露骨髓腔，用含青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓，反復(fù)吹打；將沖出的骨髓制成單細胞懸液。將沖洗下來的液體制成單細胞懸液，經(jīng)Percoll密度梯度離心法，分離和收集有核細胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸離心管中的細胞，鏡下細胞計數(shù)，使細胞密度達到1×106個/mL，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，換液，將骨髓間充質(zhì)干細胞不斷傳代、純化，得到BMSCs。BMSC-CM的收集：純化后的BMSCs，收集每次換液的培養(yǎng)基，經(jīng)1500rpm離心去除細胞碎片后，放置與-80℃冰箱保存。

（3） ELISA操作過程（參考廠家試劑盒步驟）。①向96孔板加入100μL×稀釋液，作為陰性對照。同時加入所測因子的標(biāo)準(zhǔn)品100μL到96孔板。②將所測樣品100μL加到96孔板，每個樣品2個微孔。③室溫下孵育2h，注意用錫紙包裹96孔板避光。④孵育后將每個孔內(nèi)的液體吸掉，然后每孔用400μL×沖洗液洗滌4次，每次1 ～ 2min，最后一次時將96孔板翻轉(zhuǎn)置于吸水紙上。⑤每個微孔加入200μL酶標(biāo)檢測抗體，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫下孵育2h。⑥孵育后將每個孔內(nèi)的液體吸掉，然后每孔用400μL ×沖洗液洗滌4次，每次1 ～ 2min，最后一次時將96孔板翻轉(zhuǎn)置于吸水紙上。⑦加入200μL顯色底物（顯色劑A和顯色劑B各100μL），室溫下孵育30min，從最后一個微孔加樣后開始計時。⑧加入50μL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍色變成黃色。⑨30min內(nèi)進行檢測，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中生長因子的含量。計算 VEGF， bFGF，TGF-β， HGF， IL-6 的濃度。每個樣品重復(fù)四次，每組取三個樣品。

（4）進行免疫組織化學(xué)檢測。對切除的脊髓浸泡后進行脫水與石蠟密封工作，當(dāng)進行免疫組織化學(xué)檢測工作時，采用SABC法，首先利用濃度為3%的過氧化氫對蠟片進行清洗，以此對蠟片進行殺菌工作；其次將蠟片放入0.01mol/L枸櫞酸鹽溶液中進行加熱，在常溫環(huán)境下待蠟片冷卻后滴入抗原修復(fù)液，隨后將其放入冰箱中冷藏約8 ～ 10h，將冰箱溫度設(shè)定為3.5℃。最后，將蠟片從冰箱中取出并加入二抗生物素化羊抗鼠IgG，進行約30min的孵育以此來使脊髓樣本中的膠質(zhì)纖維酸性蛋白恢復(fù)活性，加入二氨基聯(lián)苯胺與蘇木素等顯色劑在顯微鏡下進行觀察。試驗過后利用中性樹膠對蠟片進行再次密封。上述采用的所有步驟之間均需使用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液進行沖洗，并利用PBS代替一抗作為陰性對照。

（5）免疫熒光染色。將切片以 4%多聚甲醛固定 30min。用含 0.3% 或0.1%Triton X-100+10% BSA的 PBS 封閉非特異性染色。然后與一抗（anti-GFAP）4℃孵育過夜。沖洗后加入與一抗相對應(yīng)的熒光二抗，室溫孵育 1h，沖洗。用含 DAPI的封片劑（Vector Lab）封片后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.3　觀察指標(biāo)

（1）觀察原代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基情況。（2）觀察兩組大鼠的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果。（3）觀察兩組大鼠的組織病理變化。（4）觀察兩組大鼠的生物行為學(xué)變化。

1.4　統(tǒng)計學(xué)處理

本次研究的所有數(shù)據(jù)將被錄入至EXCEL中，采用 SPSS13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料應(yīng)用（x±s）表示，組間比較行t檢驗，計數(shù)資料采用（%）表示，行χ2檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2　兩組大鼠的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果比較（±s ）

表2　兩組大鼠的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果比較（±s ）

組別　n　　脊髓損傷前脊髓損傷后1d　4d　11d　21d　35d　60d　90d對照組　42　153.18±18.03　131.87±15.12　120.27±9.82　115.21±13.08　102.37±11.93　114.09±14.21　121.07±13.57　124.58±15.16觀察組　42　153.18±18.03　126.04±12.31?。?33.24±10.29）　　（135.24±9.06）　?。?69.25±9.61）　152.64±12.86　139.24±11.23　114.69±15.41 t 5.909　8.158　28.293 p 0.000　0.000　0.000

表3　兩組大鼠的BBB評分比較（分）

2　結(jié)果

2.1　原代培養(yǎng)的BMSC-CM中細胞因子含量的檢測結(jié)果

原代培養(yǎng)的 BMSCs 傳至第二代時，細胞形態(tài)為長梭形的纖維狀，折光性好（圖 1）。我們用酶聯(lián)免疫吸附法測定CM內(nèi)多種因子VEGF， bFGF，TGF-β， HGF， IL-6的含量，結(jié)果如表 1。從檢測結(jié)果來看，CM中含bFGF（16.51±3.70）pg/mL、VEGF（67.86±6.86）pg/mL、TGF-β（74.23±8.08）pg/mL、HGF（119.72±7.59）pg/mL、IL-6（92.15±6.42）pg/mL等多種細胞因子。

圖1　原代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞（標(biāo)尺為30μm）

表1　Elisa檢測骨髓源間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基內(nèi)分泌的細胞因子含量

2.2　對照組大鼠與觀察組大鼠的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果比較

觀察組大鼠在受傷后其GFAP平均灰度值便開始上升，在第21d時其水平升到最高值，隨后便開始逐漸下降。通過使用BMSC-CM，受傷第90d后其GFAP平均灰度值小于對照組大鼠，同時兩組大鼠在受傷后第4，11，21天時GFAP平均灰度值差異較大，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3　觀察組大鼠與對照組大鼠的生物行為學(xué)變化比較

觀察組大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)時間明顯短于對照組大鼠，同時在第11天與21天的BBB評分差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.4　對照組大鼠與觀察組大鼠的兩組大鼠的組織病理變化

對照組大鼠在脊髓受傷后第1天開始，其GFAP含量便開始上升，在進行脊髓壓迫手術(shù)后，隨著時間的延長，其神經(jīng)元開始逐漸萎縮，并產(chǎn)生炎性細胞浸潤現(xiàn)象。然而對于觀察組大鼠而言，雖然受傷后第1天的GFAP含量也會上升，但是上升速度卻慢于對照組大鼠，同時病變的情況要輕于對照組大鼠，見圖 2、3。

圖2　對照組大鼠受傷60d后 GFAP表達情況（標(biāo)尺為25μm）

圖3　觀察組大鼠受傷60d后GFAP表達情況（標(biāo)尺為25μm）

3　討論

脊髓對于任何生物而言都是極其重要的神經(jīng)組織，一旦受到損傷便會對生物體產(chǎn)生不良影響，因此必須及時采取有效的措施進行治療[6]。BMMSCs是具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，隨著研究的深入，MSCs 的旁分泌作用越來越引起大家的關(guān)注，大量研究表明，MSCs 分泌的多種因子具有較好的促進創(chuàng)傷愈合和功能恢復(fù)的治療效果[7-8]，其分泌的一些分子已經(jīng)證明具有抗凋亡和刺激細胞增殖的作用，例如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的增生、遷移，促進血管發(fā)生；成纖維細胞生長因子（bFGF）可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的增生；轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）可促進血管成熟；肝細胞生長因子（HGF）可抑制CD4+T細胞增殖，調(diào)節(jié)免疫；白介素6（IL-6）可調(diào)節(jié)炎癥、誘導(dǎo)VEGF的分泌等[9-10]。BMSC-CM的作用機制主要是通過抑制細胞死亡，減輕炎癥反應(yīng)，促進血管再生而實現(xiàn)對受損組織的修復(fù)。

脊髓損傷早期，膠質(zhì)瘢痕成份主要為小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、巨噬細胞和星形膠質(zhì)細胞等；損傷后期，小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和巨噬細胞逐漸被星形膠質(zhì)細胞所代替，成份較單一[11]。星形膠質(zhì)細胞的胞體體積較大，多角形，細胞核圓形或卵圓形，由胞體向四周發(fā)出幾個放射狀突起。GFAP是一種酸性蛋白，分子量為50～52KD，屬細胞骨骼蛋白，是星形膠質(zhì)細胞的標(biāo)志蛋白，其表達的高低可側(cè)面反映星形膠質(zhì)細胞增殖、肥大、壞死等改變的程度與膠質(zhì)細胞的功能狀態(tài)[12]。脊髓損傷后GFAP的表達逐漸增強，其高表達的區(qū)域即為膠質(zhì)瘢痕富集區(qū)[13]，本項實驗結(jié)果表明，通過對觀察組大鼠注射BMSC-CM，使得體內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞的生長得到了抑制，進而在較大程度上降低了GFAP含量，使得大鼠在受傷21d左右便恢復(fù)了脊髓組織的正常功能[14]依據(jù)研究結(jié)果可知，兩組大鼠在第21天時BBB評分差距最大，并且隨后觀察組大鼠的GFAP含量不斷降低，因此使得大鼠逐漸恢復(fù)健康；同時也在較大程度上為受傷的脊髓神經(jīng)提供了充足的營養(yǎng)，幫助神經(jīng)元快速修復(fù)[15-18]，能夠有效的恢復(fù)大鼠的四肢功能，避免留下不良的后果，進而能夠有效的提升大鼠的預(yù)后質(zhì)量。除此之外，由于在脊髓受傷后GFAP的含量值上升較慢，也在在較大程度上降低了術(shù)后神經(jīng)元萎縮的速度，進而使得炎性細胞的浸潤速度減緩，因而觀察組大鼠能夠在較短時間內(nèi)得以恢復(fù)。通過上述結(jié)果可充分表明，BMSC-CM能夠有效的修復(fù)大鼠受傷的脊髓組織[19]，并降低慢性脊髓損傷后GFAP的表達量，對于大鼠而言具有重要作用[20]。產(chǎn)生上述結(jié)果的總體原因在于GFAP的表達量受到了嚴重的抑制，因而其含量不斷降低，避免了炎癥細胞因子的產(chǎn)生，進而縮短了恢復(fù)時間。

綜上所述，我院認為使用BMSC-CM能夠有效的降低大鼠慢性脊髓損傷后GFAP表達量，同時提升BBB評分，進而使受傷大鼠快速恢復(fù)健康。通過大鼠實驗表明，BMSC-CM對脊髓損傷后功能的恢復(fù)，具有重要的臨床意義。本次研究樣本容量有限，今后仍需大樣本隨機進一步觀察。

[參考文獻]

[1] Quertainmont R， Cantinieaux D， Botman O， et al.Mesenchymal stem cell graft improves recovery after spinal cord injury in adult rats through neurotrophic and proangiogenic actions [J]. PloS One，2012 ， 7 （6） ：e39500.

[2] Karaoz E， Kabatas S， Duruksu G， et al. Reduction of lesion in injured rat spinal cord and partial functional recovery of motility after bone marrow derived mesenchymal stem cell transplantation [J]. Turk Neurosurg， 2012， 22（2）：207 -217.

[3] Timmers L， Lim SK， Hoefer IE， et al. Human mesenchymal stem cell-conditioned medium improves cardiac function following myocardial infarction[J]. Stem Cell Res， 2011， 6（3）：206 -214.

[4] Kim HJ， Lee JH， Kim SH. Therapeutic effects of human mesenchymal stem cells on traumatic brain injury in rats：secretion of neurotrophic factors and inhibition of apoptosis[J].Journal of Neurotrauma， 2010， 27（1）： 131-139.

[5] 陳春梅.原花青素對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐，2015，21（8）：883-888.

[6] 王法臣，江慧，張偉，等.PPAR-γ對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能影響的研究[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2015，14（5）：389-392.

[7] Mirotsou M， Jayawardena TM， Schmeckpeper J， et al.Paracrine mechanisms of stem cell reparative and regenerative actions in the heart[J]. Journal of molecular and cellular cardiology， 2011， 50（2）： 280-289.

[8] Bruno S， Grange C， Deregibus MC， et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury [J]. Journal of the American Society of Nephrology ： JASN， 2009， 20（5）： 1053-1067.

[9] Seval Y，Sati L，Celik—Ozenci C，et al.The distribution of angiopoietin-1，angiopoietin-2and their receptors tie--1 and tie--2 in the very early human placenta[J].Placenta，2008，29（9）：809-815.

[10] Demir R，Kayisli U A，Cayli S，et al.Sequential steps during vasculogenesis and angiogenesis in the very early human placenta[J].Placenta，2006，27（6-7）：535-539.

[11] Silver J， Miller JH. Regeneration beyond the glial scar[J].Nat Rev Neurosci， 2004，5（2）： 146-156.

[12] Eng LF， Ghirnikar RS， Lee YL. Glial fibrillary acidic protein： GFAP-thirty-one years （1969-2000）[J].Neurochem Res，2000，25（9-10）： 1439-1451.

[13] Huang X， Kim JM， Kong TH， et al. GM-CSF inhibits glial scar formation and shows long-term protective effect after spinal cord injury[J]. J Neurol Sci，2009，277（1-2）：87-97.

[14] 許盈盈，黃銀輝，陳雅芳，等.慢性間歇性缺氧對大鼠認知功能及腦室旁白質(zhì)膠質(zhì)細胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白、S100B 表達的影響 [J].中國老年學(xué)，2016，36（20）：4987-4990.

[15] 葉緣苑，王高華，王惠玲，等.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激大鼠行為和海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達的影響[J].中華精神科雜志，2012，45（5）：299-303.

[16] 劉紅，萬朝權(quán)，田可耘，等.加巴噴丁聯(lián)合嗎啡對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓膠質(zhì)原纖維酸性蛋白表達的影響 [J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（23）：3869-3871.

[17] 邵波，陳鈺，彭余江，等.黃體酮對顱腦損傷大鼠腦組織中Nogo-A、膠質(zhì)纖維酸性蛋白及胰島素樣生長因子 -1表達影響的研究 [J].浙江醫(yī)學(xué)，2015，37（18）：1510-1514.

[18] 皮斌，熊巍，孫揚，等.大鼠脊髓損傷后GFAP、cPLA2的表達變化及相關(guān)性研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（32）：31-35.

[19] 徐紀(jì)偉，孫丹華.麻黃堿對大鼠脊髓半切損傷后神經(jīng)生長蛋白43和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，30（5）：718-721.

[20] 陳春梅.經(jīng)皮電刺激夾脊穴對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白及炎癥反應(yīng)的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐，2016，22（6）：660-666.