海水養(yǎng)殖中水產(chǎn)動物主要致病弧菌研究進(jìn)展

王鳳青, 孫玉增，任利華，姜向陽，姜芳，崔艷梅，劉麗娟

(山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺 264006)

中國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的65%[1]，為世界水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展做出了重大的貢獻(xiàn)。2005—2015年，中國的海水養(yǎng)殖面積年均增長率為3.61%，海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量年均增長率為3.25%[2]。隨著海水養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展和集約化養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，海水養(yǎng)殖病害也呈多發(fā)趨勢。在海水養(yǎng)殖感染的病原菌中，弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌(以下簡稱“弧菌”)占有相當(dāng)大的比例，致病性弧菌被認(rèn)為是海水魚類和貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的“災(zāi)禍之源”[3]，如2011年發(fā)生在山東省境內(nèi)的流行性傳染病造成紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)大量死亡，Wu等[4]從死亡的紅鰭東方鲀中分離到哈維氏弧菌(V.harveyi)、輪蟲弧菌(V.rotiferianus)和歐文斯氏弧菌(V.owensii)；Levican和Avendaňo-Herrera[5]在大量死亡的紅鰻幼體中，分離出鰻弧菌(V.anguillarum)和奧氏弧菌(V.ordalii)；鯊魚弧菌能造成鯊魚網(wǎng)狀內(nèi)皮的囊泡化，體表出血[6]；病海魚弧菌(V.ordalii)能夠造成鮭產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[7]。

弧菌是一類革蘭氏陰性細(xì)菌，化能異養(yǎng)、兼性厭氧，細(xì)胞呈現(xiàn)短桿狀、彎曲狀、S形或螺旋形等多形態(tài)；大部分弧菌都靠鞭毛運(yùn)動，多為單端極生鞭毛，但也有一端可見多根鞭毛的現(xiàn)象，如費(fèi)氏弧菌(V.fischeri)[8]?；【?216E平板上可以生長，菌落呈乳白色、有凸起、邊緣光滑。在硫代硫酸檸檬酸膽鹽蔗糖(TCBS)選擇培養(yǎng)基上，能發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸的弧菌菌落呈黃色，如霍亂弧菌(V.cholerae)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)；不能發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸的弧菌菌落呈綠色，如創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)。

截至2016年，弧菌屬共發(fā)現(xiàn)126個種和2個亞種，其中近100種弧菌為水生環(huán)境土著細(xì)菌[9]，國內(nèi)外公認(rèn)的致病性弧菌約有20種[10]。本文選擇鰻弧菌(V.anguillarum)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和溶藻膠弧菌(V.alginolyticus)4種中國海水養(yǎng)殖中常見的致病性弧菌，分別介紹其菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性、引發(fā)疾病類型及危害、致病機(jī)理和分子生物學(xué)研究進(jìn)展，以期為海水養(yǎng)殖中弧菌性疾病防治研究提供參考。

1　鰻弧菌

1.1　生物學(xué)特性

鰻弧菌(V.anguillarum)呈彎曲桿狀，具單生或周身鞭毛(圖1)。分離于海洋環(huán)境，溫度高于40 ℃或無氯化鈉時不生長?；墚愷B(yǎng)，氧化酶陽性，于TCBS培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h可形成黃色菌落，而后慢慢轉(zhuǎn)變成綠色[11]。

圖1　鰻弧菌細(xì)胞形態(tài)[12]Fig.1　Cellular morphology of V. anguillarum[12]

1.2　流行病學(xué)特征

鰻弧菌是第一個被鑒定的魚類病原菌[13]，可引起鰻鱺感染出血性敗血癥，發(fā)病魚體表有明顯出血現(xiàn)象，鰓蒼白、皮下組織水腫、眼球突出、腸道膨脹并且充滿黏稠液體[3]。鰻弧菌主要是經(jīng)由皮膚或口腔攝入感染魚體[14]。現(xiàn)今證實(shí)，鰻弧菌可引起太平洋鮭、大西洋鮭、虹鱒、大菱鲆、鱸、海鯉、條紋鱸、鱈和香魚等50多種魚類發(fā)病[11, 15]。

1.3　致病機(jī)理

鰻弧菌有23個血清類型(O1～O23)，只有O1、O2和少部分O3血清型的鰻弧菌可以致病[16]，其他血清型的鰻弧菌為環(huán)境微生物，與魚類的致病幾乎沒有相關(guān)性。O1、O2血清型鰻弧菌的分布比較廣泛，O3血清型鰻弧菌僅可感染鰻鱺和香魚[14]。鰻弧菌的致病過程包括吸附、侵襲、體內(nèi)增殖及產(chǎn)生毒素等步驟。鰻弧菌通過吸附并入侵魚體的通道主要包括皮膚、鰓、側(cè)線和腸道[17]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)毒力因子有鞭毛[18]、鐵捕獲系統(tǒng)[19]、外膜蛋白[20]、蛋白酶[21]和溶血素[22]等。

1.4　分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀

對于鰻弧菌而言，鞭毛除提供動力侵入細(xì)胞外，還可產(chǎn)生黏附素，有助于細(xì)菌在細(xì)胞的表面吸附以及侵襲和定居。鞭毛的主動運(yùn)動可協(xié)助細(xì)菌在體外和體內(nèi)入侵細(xì)胞[23]。鰻弧菌鞭毛鞘主要成分為脂多糖(LPS)，即內(nèi)毒素，一般由3個部分共價連接而成：O-特異性多糖鏈、核心多糖和類脂A，其中類脂A是脂多糖的毒性成分。對O1型和O2a血清型鰻弧菌，光滑型LPS的菌株對魚體有致病力，而粗糙型菌株對魚體無致病力。宿主細(xì)胞和海水環(huán)境的鹽濃度有所不同，鰻弧菌外膜蛋白在適應(yīng)這種滲透壓的變化中起著至關(guān)重要的作用，提供特異和非特異的通道供養(yǎng)分和離子通過，調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，防止細(xì)胞裂解，執(zhí)行著細(xì)菌吸附、侵襲等功能[24]。目前為止，鰻弧菌中發(fā)現(xiàn)兩種鐵載體依賴系統(tǒng)，一個是由質(zhì)粒pJM1調(diào)節(jié)，質(zhì)粒pJM1為65 kb，包含了鐵載體-弧菌素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的大部分編碼基因[25]，弧菌素系統(tǒng)只存在攜帶病原質(zhì)粒的O1血清型鰻弧菌中[26]。另一系統(tǒng)存在于O2血清型和缺少質(zhì)粒的O1血清型鰻弧菌中[27]。

溶血素是單一的多肽分子，可溶解紅細(xì)胞，釋放出胞內(nèi)血紅蛋白，具有細(xì)胞毒性和動物致死性[28]。除血紅細(xì)胞外，溶血素還可以溶解其他細(xì)胞，如肥大細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和多形核白血球等[24]。Li等[29]發(fā)現(xiàn)能導(dǎo)致鰻弧菌溶血的毒素操縱子rtx(包括rtxA、rtxB、rtxC、rtxD、rtxE和rtxH6個基因)，其中rtxA編碼rtx毒素，rtxC編碼rtx毒素激活蛋白，rtxH編碼一個保守假定蛋白，rtxB，rtxD和rtxE編碼rtx毒素的運(yùn)輸者。vah1基因簇可以調(diào)節(jié)溶血素的毒力作用，當(dāng)鰻弧菌的vah1位點(diǎn)發(fā)生突變時溶血性減弱[30]。

2　哈維氏弧菌

2.1　生物學(xué)特性

哈維氏弧菌(V.harveyi)是一種在海洋中分布廣泛的革蘭氏陰性細(xì)菌，于1963年被發(fā)現(xiàn)，不能夠形成莢膜，無芽孢，能夠產(chǎn)H2S，但不能產(chǎn)生吲哚，單端極生鞭毛[31]，能夠發(fā)出熒光且生活需要氯化鈉[32]，是常見的海洋動物致病菌[33]。在TCBS培養(yǎng)基上能夠形成較大且邊緣平滑的黃色菌落。

2.2　流行病學(xué)特征

哈維氏弧菌一般流行于夏季，主要感染對象是對蝦、虹鱒、大西洋鮭、牙鲆、黑石斑魚和大菱鲆等[34-35]。Alvarez等[36]針對1993年至1996年期間委內(nèi)瑞拉病死的對蝦進(jìn)行調(diào)查，實(shí)驗(yàn)證明哈維氏弧菌的感染是導(dǎo)致該時期內(nèi)委內(nèi)瑞拉養(yǎng)殖魚類和對蝦的高死亡率主要因素；Pizzutto等[37]報(bào)道了哈維氏弧菌導(dǎo)致澳大利亞的斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)大量死亡。也有報(bào)道菲律賓斑節(jié)對蝦蝦苗孵化場感染哈維氏弧菌并且導(dǎo)致蝦苗大量死亡的案例[38]。2015年山東省某地混合養(yǎng)殖的石斑魚中曾被報(bào)道因感染哈維氏弧菌而暴發(fā)石斑魚皮膚潰瘍病。哈維氏弧菌引起的病癥癥狀各不相同，但一般都會有厭食、眼球突出、體表出血的癥狀[10]，更有甚者會出現(xiàn)鱗片脫落、皮膚及肌肉潰爛、脾臟膨脹等癥狀。

2.3　致病機(jī)理

目前研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌致病相關(guān)因子主要包括蛋白酶[39]、溶血素[40]、外毒素[41]和脂多糖[42]等胞外產(chǎn)物(extracellular products, ECP)。哈維氏弧菌的鞭毛除了行使運(yùn)動功能外，還可以起到吸附的作用。大部分細(xì)菌的致病作用是從吸附開始的，黏附素和受體是參與黏附的主要物質(zhì)[43]。除此之外，哈維氏弧菌的致病性可能與噬菌體有關(guān)，噬菌體可以介導(dǎo)毒力基因的轉(zhuǎn)移[10]。

2.4　分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀

Castillo等[44]自希臘克里特島感染弧菌病的幼年杜氏鰣(Serioladumerili)中分離到菌株VH2和VH5，并對這兩株菌的全基因組序列進(jìn)行了比較分析。菌株VH2基因組G+C含量為45 mol%，包含5 079個編碼基因、33個tRNA、38個假基因和3個rRNA；菌株VH5包含5 254個編碼基因、93個tRNA、56個假基因和3個rRNA。發(fā)現(xiàn)菌株毒力因子與編碼黏附素、降解膽汁、產(chǎn)生Ⅴ型大腸桿菌素等活動相關(guān)。有趣的是，在菌株VH5基因組中發(fā)現(xiàn)了霍亂毒素編碼基因和小帶聯(lián)結(jié)毒素編碼基因。Yu等[45]對分離自中國大亞灣患病斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)的哈維氏弧菌E385進(jìn)行了全基因組序列分析。菌株E385基因組G+C含量為44.8 mol%，有119個預(yù)測蛋白屬于U家族(與胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌、膜泡運(yùn)輸相關(guān))，77個預(yù)測蛋白屬于V家族(與防衛(wèi)機(jī)制相關(guān))，通過在線預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)了85個毒力基因，這些數(shù)據(jù)顯示該菌株對宿主有較強(qiáng)的毒力作用。

哈維氏弧菌的快速檢測技術(shù)一直倍受關(guān)注，Gomez等[46]通過擴(kuò)增3個保守蛋白編碼基因(topA、ftsZ和mreB)，簡單、快速的鑒定區(qū)分親緣關(guān)系較近的病原菌(包括哈維氏弧菌)。Cao等[47]根據(jù)哈維氏弧菌的toxR基因序列設(shè)計(jì)兩對引物，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速、高特異性地檢測海水養(yǎng)殖環(huán)境中的哈維氏弧菌。Li等[48]利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物替代蛋白質(zhì)印跡分析中傳統(tǒng)的四甲基聯(lián)苯胺，建立了快速高靈敏性檢測哈維氏弧菌的方法。

3　副溶血弧菌

3.1　生物學(xué)特性

副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)是一種多態(tài)桿狀或輕微彎曲桿狀細(xì)菌，菌體單端極生鞭毛，運(yùn)動活潑，無芽孢、無莢膜。廣泛分布于海洋、河口及海灣[49-50]，兼性厭氧，嗜鹽嗜溫，最適生長溫度為30～37 ℃，4 ℃時進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but nonculturable, VBNC)。能夠發(fā)酵葡萄糖、甘露糖，不能發(fā)酵蔗糖、乳糖。在TCBS培養(yǎng)基上形成藍(lán)綠色菌落，邊緣不整齊，表面有隆起、濕潤不透明。

3.2　流行病學(xué)特征

副溶血弧菌流行于夏季，可導(dǎo)致貝類[51]、甲殼類[52]、魚類[53]等發(fā)病。發(fā)病的蝦類主要表現(xiàn)為紅腿病或者爛鰓病，進(jìn)食減少或者停止進(jìn)食、運(yùn)動活力下降，有的會伴隨出現(xiàn)腸炎癥狀。

3.3　致病機(jī)理

研究表明，副溶血弧菌的致病過程包括黏附、侵襲、體內(nèi)增殖及產(chǎn)生毒力因子等步驟[54]。黏附作用的本質(zhì)是致病菌外膜的特殊結(jié)構(gòu)與宿主表面相應(yīng)受體相互作用，致使病原菌選擇性的黏附于宿主細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與副溶血弧菌黏附作用相關(guān)的因子主要為纖毛和細(xì)胞血凝素(cell-associated hemagglutinin, CHA)[55]。副溶血弧菌的毒力因子主要有溶血性毒素、黏附蛋白、耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin, TDH)、溶血相關(guān)毒素蛋白(TDH-related Hemolysin, TRH)和Ⅲ型分泌系統(tǒng)(the type III secretion system, T3SS)等[56]。

3.4　分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀

TDH和TRH免疫學(xué)性質(zhì)相近，二者分別由tdh和trh基因編碼，tdh和trh基因同源性達(dá)70%[57]。TDH是一種造孔毒素，有溶血活性、細(xì)胞毒性、心肌毒性和腸毒素等活性，能夠在血紅細(xì)胞膜上造成孔洞[58]，一定大小的孔洞能夠改變腸道細(xì)胞膜的離子流，造成腹瀉等癥狀。副溶血弧菌流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，環(huán)境分離菌株和水產(chǎn)品菌株極少攜帶tdh和trh，所以自然界中大多副溶血弧菌為非致病菌[59]。TDH和TRH并不能完全解釋副溶血弧菌的致病機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)部分致病性副溶血弧菌并沒有攜帶tdh或者trh基因但依然能夠?qū)е滤拗髦虏?，Nishibuchi等[60]從臨床病例中分離到一株致病副溶血弧菌，研究發(fā)現(xiàn)該菌株并不產(chǎn)TDH。據(jù)Pendru等[61]報(bào)道，缺少tdh和trh基因的致病性副溶血弧菌能夠產(chǎn)生胞外蛋白酶、生物膜、嗜鐵素和細(xì)胞毒素等毒性因子，導(dǎo)致宿主患病。

T3SS與許多革蘭氏陰性病原菌毒性因子的分泌有關(guān)，全基因組測序分析數(shù)據(jù)顯示兩個基因簇T3SS1和T3SS2編碼了Ⅲ型分泌系統(tǒng)，其中T3SS1位于大染色體上，T3SS2位于小染色體上[50]。目前研究發(fā)現(xiàn)T3SS1可轉(zhuǎn)位4個效應(yīng)蛋白(VopQ、VopR、VopS和VPA0450)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性，使細(xì)胞裂解，內(nèi)容物外流[62-64]。Park等[65]敲除T3SS1結(jié)構(gòu)蛋白VcrD1基因后，副溶血弧菌對HeLa細(xì)胞的毒性降低，將VcrD1基因互補(bǔ)表達(dá)后副溶血弧菌的毒性恢復(fù)。

4　溶藻膠弧菌

4.1　生物學(xué)特性

溶藻膠弧菌(V.alginolyticus)是短桿狀革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體首尾相連可呈現(xiàn)“C”或“S”形。溶藻膠弧菌是革蘭氏陰性海生弧菌，無芽孢、莢膜，嗜鹽嗜溫、兼性厭氧，在TCBS培養(yǎng)基上培養(yǎng)可生成黃色菌落。

4.2　流行病學(xué)特征

溶藻膠弧菌能夠使大菱鲆、大黃魚、石斑魚等致病，夏季多發(fā)，發(fā)病魚的主要癥狀是運(yùn)動力下降、皮膚灰暗、鱗片松散并且會伴隨體表潰瘍，解剖后會發(fā)現(xiàn)肝臟、腸壁毛細(xì)血管和消化道等充血、充水的明顯癥狀[10]。除了可以引起魚類、蝦類和貝類致病以外，溶藻膠弧菌還可引起珊瑚白化病[66]。

4.3　致病機(jī)理

溶藻膠弧菌的致病性主要取決于宿主所在環(huán)境與菌體本身的關(guān)系。研究表明，來源于健康宿主的溶藻膠弧菌與來源于發(fā)病宿主的溶藻膠弧菌菌體間存在差異，最明顯的表現(xiàn)就是二者在TCBS培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)不同[66]。溶藻膠弧菌的致病過程包括吸附、侵襲、體內(nèi)增殖等步驟，致病作用主要是通過產(chǎn)生致病因子對宿主機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生損害以及對新陳代謝產(chǎn)生干擾而發(fā)生的。溶藻膠弧菌致病因子包括黏附素、胞外產(chǎn)物、脂多糖、外膜蛋白及鐵載體等[10]。細(xì)菌的吸附過程除了與菌體自身的特性如運(yùn)動性、趨向性等有關(guān)外，還與宿主細(xì)胞表面特異性受體相關(guān)。Balebona等[67]對溶藻膠弧菌胞外產(chǎn)物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有酪蛋白酶、淀粉酶、明膠酶和磷脂酶等酶活性，并且對多種魚類細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性。溶藻膠弧菌引起珊瑚白化病的致病機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4.4　分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀

致病性溶藻膠弧菌存在種內(nèi)差異，在被檢測的致病性溶藻膠弧菌中，53%不攜帶質(zhì)粒，其余47%檢測出12種質(zhì)粒，分屬8個類型[68]。Xie等[69]在對分離自中國廣東省近海海水養(yǎng)殖環(huán)境的72株溶藻膠弧菌毒力基因的研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)毒力基因與致病性的相關(guān)性。例如4株溶藻膠弧菌GS03008、GS03011、GS03023和GS03024具有致病性，但沒有檢測到任何毒力基因；相反，在菌株ZJ03010、RP04102及RP04109等溶藻膠弧菌中檢測到了毒力基因，而這些菌株并沒有表現(xiàn)出致病性，這說明溶藻膠弧菌可能具有一套獨(dú)特的毒力基因和致病機(jī)制。

5　展望

中國具有相對優(yōu)越的海水養(yǎng)殖條件，大陸海岸線長達(dá)18 000 km，管轄在內(nèi)的海域面積達(dá)300萬km2之余，10 m等深線以內(nèi)的海灘和淺海海域面積達(dá)1.0×105km2，其中，適合海水養(yǎng)殖的海域面積達(dá)1.3×104km2[70]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年中國水產(chǎn)品總產(chǎn)量為64 615 174 t，其中，海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量為18 126 481t[2]，占水產(chǎn)品總產(chǎn)量的28.05%。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的增加和養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，弧菌病害對海水養(yǎng)殖的負(fù)面影響越發(fā)不容忽視，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中弧菌病防治的研究越來越受重視。近年來，隨著分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄組、基因組及宏基因組等分析技術(shù)的不斷發(fā)展，弧菌的致病機(jī)制越來越清晰。

目前，全球都將目光聚焦在構(gòu)建生態(tài)和諧、環(huán)境友好上。在各種致病菌治療手段的研究中，生態(tài)友好類的治療方式越來越受關(guān)注，在現(xiàn)存的化學(xué)、物理和生物防治手段中，應(yīng)用生物手段防治細(xì)菌性疾病的優(yōu)勢明顯。因此，在未來的研究中，應(yīng)更加關(guān)注致病性細(xì)菌的抗生素敏感性，檢測現(xiàn)有的治療手段是否對環(huán)境造成了危害；研發(fā)弧菌疫苗，通過高效的弧菌疫苗替代污染性高的化學(xué)抑菌方法，在減少對環(huán)境破壞的同時有效抑制致病性弧菌；通過抑菌圈檢測等方法篩選可殺死或者抑制致病性弧菌的菌株，研究其抗菌或抑菌機(jī)制，分離與之相關(guān)的次級代謝產(chǎn)物，研發(fā)新的高效無污染的微生物防治產(chǎn)品，以期在水產(chǎn)弧菌病的防治方面有新的突破。具有捕食功能的菌體，尤其是對致病性菌具有捕食功能的菌體，極有可能開發(fā)成微生態(tài)制劑，利用微生態(tài)制劑防治水產(chǎn)養(yǎng)殖中的相關(guān)疾病，將是解決以上問題的一個很好的途徑。蛭弧菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用就是一個成功的案例。蛭弧菌對諸多水產(chǎn)品的病原菌(沙門菌屬、志賀菌屬、埃希菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、歐文菌屬、變形桿菌屬和弧菌屬球菌)均具有較強(qiáng)的裂解活性，特別是對弧菌屬、沙門菌屬和志賀菌屬。不僅可以預(yù)防疾病，而且能改善養(yǎng)殖環(huán)境，有望成為抗生素的替代品，作為一種“生物漁藥”在水產(chǎn)動物的健康養(yǎng)殖中發(fā)揮極其重要的作用，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)和社會效應(yīng)[71]。

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