厭氧微生物培養(yǎng)實驗教學(xué)改革與實踐

蔣海明，　李　俠，　劉振旺，　張　鵬，　李　玲，　趙宏宇

(內(nèi)蒙古科技大學(xué) a. 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；b. 礦業(yè)研究院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

0　引　言

厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，作用也日益引起重視。厭氧微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵是要使該類微生物接種及培養(yǎng)時都處于無氧的環(huán)境中。目前，厭氧微生物培養(yǎng)一般采用堿性焦性沒食子酸法[1-3]、皰肉培養(yǎng)基法[4-6]、厭氧罐培養(yǎng)法[4，7]及厭氧手套箱[8-9]。堿性焦性沒食子酸法無需特殊及昂貴的設(shè)備，操作簡單，適于任何可密封的容器，可迅速建立厭氧環(huán)境，而其缺點是在氧化過程中會產(chǎn)生少量的一氧化碳，對某些厭氧菌的生長有抑制作用。皰肉培養(yǎng)基法常用于厭氧微生物的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，且通用性較差，只能適用特定厭氧微生物的培養(yǎng)。厭氧罐不能實現(xiàn)培養(yǎng)基配制、微生物接種環(huán)節(jié)的厭氧環(huán)境，只能保證培養(yǎng)過程的厭氧環(huán)境。厭氧培養(yǎng)箱雖既可用于厭氧微生物培養(yǎng)，也能厭氧微生物接種，但也存在許多不足，如操作不方便、儀器昂貴、體積較大、不適合極端厭氧微生物(如海底菌種、深層土壤菌種)培養(yǎng)以及不能恒溫，也不能制備厭氧培養(yǎng)基。針對堿性焦性沒食子酸法與皰肉培養(yǎng)基法培養(yǎng)基制備過程中存在的不足，開發(fā)了厭氧培養(yǎng)基制備裝置[10-12]，但這些裝置沒有設(shè)計脫氧裝置，無法滿足嚴格厭氧微生物的生長，且無法實現(xiàn)接種。于東寧等[13-14]開發(fā)了厭氧微生物接種裝置及厭氧微生物培養(yǎng)系統(tǒng)，但這些裝置同樣沒有設(shè)計脫氧裝置，無法滿足嚴格厭氧微生物的生長，且無法實現(xiàn)厭氧培養(yǎng)基制備。此外，這些裝置不易實現(xiàn)不同培養(yǎng)氣氛的變化。

針對現(xiàn)有實驗室厭氧微生物培養(yǎng)技術(shù)及裝置存在的問題，本文研究設(shè)計了一種厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)裝置，該裝置體積小、制作簡單、易于操作，可在空氣中自由操作等優(yōu)點，適用于各種環(huán)境的厭氧微生物的培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)。本裝置為我?！拔⑸飳W(xué)”“環(huán)境微生物技術(shù)”及“發(fā)酵工程”的實驗教學(xué)創(chuàng)造了良好的實驗平臺并取得了很好的效果。

1　厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置設(shè)計與制備

1.1　厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置設(shè)計

根據(jù)厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)的要求和特點，設(shè)計了厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)裝置，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

鋼瓶中的N2、CO2或H2/CO2經(jīng)減壓閥、氣體流量計及三通閥后進入高溫帶紫銅絲的密封玻璃管中脫氧，然后分成兩路，一氣路為厭氧接種，另一氣路為厭氧培養(yǎng)基制備及厭氧培養(yǎng)。通過調(diào)節(jié)調(diào)壓閥、氣體流量計及三通閥，可以制備不同氣氛的厭氧培養(yǎng)基及適應(yīng)不同氣氛與極端環(huán)境的厭氧微生物培養(yǎng)。

圖1厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖

1.氣體鋼瓶；2.鋼瓶減壓閥；3.外徑1/8′不銹鋼管；4.浮子氣體流量計；5.卡套式三通接頭；6.卡套式三通球閥；7.橡膠管；8.電線；9.玻璃纖維發(fā)熱絲；10.紫銅絲；11.玻璃管；12.整體式閥帽針閥；13.撥動開關(guān)閥；14.橡膠管；15.14G不銹鋼針頭；16.厭氧瓶；17.玻璃注射器；18.20G不銹鋼針頭；19.單相接觸式調(diào)壓器

1.2　厭氧接種及培養(yǎng)裝置的加工與組裝

按照厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置的設(shè)計購買相關(guān)的組件：3個40 L 氣體鋼瓶，3個鋼瓶減壓閥(LFR91F11S，德國LOCKE)，1個卡套式三通球閥(SS-41GXS2，美國Swagelok)，2個整體式閥帽針閥(SS-ORS2-PK，美國Swagelok)，7個卡套式三通接頭(LQT-3，德國LOCKE)，3個浮子氣體流量計(LWTM6，德國LOCKE)，6個撥動開關(guān)閥(SS-OGS2，美國Swagelok)，1個單相接觸式調(diào)壓器(0～250 V，3 kW)，1根兩端帶接口的石英玻璃管(?3.5 cm×55 cm)，2個短管卡套式接頭(LHYP，德國LOCKE)，12 m 1/8′不銹鋼管(德國LOCKE)，2 m外徑為13 mm的橡膠管，4.5 m外徑為5 mm橡膠管，4 m玻璃纖維發(fā)熱絲(電阻絲?0.5 mm)，6 m電線，不銹鋼板(45 cm×60 cm×0.2 cm)，4個喉箍，不銹鋼針頭，厭氧瓶及紫銅絲若干。圖2所示為厭氧接種及培養(yǎng)裝置各主要組件的實物圖。

圖2厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)裝置各主要組件的實物圖

將不銹鋼板的長邊向內(nèi)折疊15 cm作為底座，且底座面與控制面板面成80°夾角，然后根據(jù)組件的尺寸大小及相對位置，按照圖3所示的尺寸采用機械鉆孔機在不銹鋼板上加工出不同的圓孔分別用于固定三通球閥、整體式閥帽針閥、浮子氣體流量計及撥動開關(guān)閥(見圖4(a))。設(shè)計時所有孔的直徑比組件的直徑大1.5～2 mm，以利于組件的安裝。利用鋼鋸將不銹鋼管切割成端口平滑的不銹管短管：4 cm 4根，3.5 cm 6根，3 cm 8根，9 cm 1根，10 cm 2根，19 cm 1根，43 cm 1根，27 cm 1根，30 cm 2根，20 cm 1根，2.8 m 2根及3.2 m 1根。不銹管短管端口用1 000目砂紙打磨光滑后待用。

圖3控制面板結(jié)構(gòu)示意圖

圖4厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)裝置安裝過程示意圖

組件安裝過程如下：

(1) 將浮子氣體流量計固定到控制面板上(見圖4(b))；

(2) 用長度為4 cm的不銹鋼管將5個卡套式三通接頭連接；最右邊的卡套式三通接頭與撥動開關(guān)閥間用長度為9 cm的不銹鋼管連接，與其他撥動開關(guān)閥間用長度為3.5 cm的不銹鋼管連接；最左邊卡套式三通接頭與整體式閥帽針閥用19 cm的不銹鋼管連接；兩個整體式閥帽針閥間用長度為3 cm的不銹鋼管鏈接一個卡套式三通接頭；所有撥動開關(guān)閥的另一端連接3 cm的不銹鋼短管(見圖4(c))(注：卡套連接時，螺母擰1 又1/4圈)；

(3) 將圖4(c)所示組件與球閥安裝到控制面板上(見圖4(d))；

(4) 按圖1所示，N2、CO2氣體流量計與三通接頭兩端之間用2根10 cm的不銹鋼短管連接，三通接頭上端與三通球閥的左端用27 cm不銹鋼短管連接；H2/CO2氣體流量計與三通球閥的右端用43 cm不銹鋼短管連接；三通球閥的下端通過80 cm不銹鋼短管及30 cm橡膠管(?13 mm)與玻璃管下端連接；玻璃管下端通過30 cm橡膠管(?13 mm)及80 cm不銹鋼短管與兩個整體式閥帽針閥間的三通接頭連接； 80 cm橡膠管(?5 mm)通過45 cm不銹鋼短管與位于上部的整體式閥帽針閥連接；40 cm橡膠管(?5 mm)與撥動開關(guān)閥連接；減壓閥與氣體流量計間分別用2根2.8 m及1根3.2 m不銹鋼管連接(見圖4(e)、(f))；

(5) 將減壓閥與鋼瓶連接、玻璃纖維發(fā)熱絲通過電線與調(diào)壓器連接，以完成整個裝置的安裝(見圖5)。

圖5　厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種及培養(yǎng)裝置實物圖

1.3　厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置氣密性檢測

以氮氣為檢測氣，對安裝好的厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置的氣密性進行檢測。將裝置連接到N2氣體鋼瓶上，打開所有閥門，用止水夾將等橡膠軟管回折密封，然后將肥皂水依次滴加到所有的連接接頭上，以對各個接頭的氣密性進行檢查。如果滴加肥皂水的接頭冒泡，則說明該接頭有泄漏，否則說明該接頭氣密封好。通過對各個接頭氣密性的檢測，以檢驗厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置的氣密性。

2　厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置實踐

利用自制實驗室簡易厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置培養(yǎng)GeobactersulfurreducensPCA(ATCC 51573)及Geobactergrbiciae(ATCC BAA-46)與Methanosarsinabarkeri800(ATCC 43569，DSM 800)的co-culture，以檢驗該裝置的有效性。

2.1　Geobacter sulfurreducens PCA的培養(yǎng)

GeobactersulfurreducensPCA的培養(yǎng)參考Summers等[15]的方法。將NBF(Media NB with Fumarate)培養(yǎng)基置于三角瓶中，用鋁箔紙密封后煮沸，然后將煮沸的培養(yǎng)基置于冰域中，利用厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置中的厭氧接種氣路通入N2/CO2(V/V=80∶20)混合氣使其冷卻至室溫。156 mL厭氧瓶先用厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置脫氧10 min，然后用電動移液器量取45 mL NBF培養(yǎng)基至厭氧瓶中，厭氧瓶插入曝氣針后塞上丁基橡膠塞，N2/CO2(80/20，V/V)曝氣40 min后鋁蓋密封，121 °C滅菌30 min后冷卻到室溫待用。制備好的培養(yǎng)基通過接種氣路用1 mL注射器加入0.75 mL微量微生素溶液及0.5 mL乙酸溶液(2 mol/L)，厭氧氣路接種GeobactersulfurreducensPCA(10%接種量，V/V)后置于30 °C下培養(yǎng)。圖6為使用本研究設(shè)計的厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種與培養(yǎng)裝置培養(yǎng)GeobactersulfurreducensPCA情況。圖6(a)為未接種G.suifurreducensPCA的NBF培養(yǎng)基，圖6(b)為接種G.suifurreducensPCA并培養(yǎng)一周后的NBF培養(yǎng)基。從圖6中能夠看出未接種G.suifurreducensPCA的NBF培養(yǎng)基顏色沒有發(fā)生變化，而接種G.suifurreducensPCA并培養(yǎng)一周后的NBF培養(yǎng)基由無色變?yōu)榉奂t色，菌種生長良好，這表明該厭氧環(huán)境滿足G.suifurreducensPCA的生長要求。

圖6接種G.suifurreducensPCA前后NBF培養(yǎng)基顏色變化

2.2　G. grbiciae與M. barkeri co-culture的培養(yǎng)

G.grbiciae與M.barkerico-culture的培養(yǎng)參考Rotaru等[16]的方法。將NBM(Media NB modified)培養(yǎng)基置于三角瓶中，用鋁箔紙密封后煮沸，然后將煮沸的培養(yǎng)基置于冰域中，利用厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置中的厭氧接種氣路通入N2/CO2(V/V=80∶20)混合氣使其冷卻至室溫。156 mL厭氧瓶先用厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置脫氧10 min，然后用移液器量取45 mL NBM培養(yǎng)基至厭氧瓶(內(nèi)置1 g顆?；钚蕴?Granular Active Carbon，GAC))中，厭氧瓶插入曝氣針后塞上丁基橡膠塞，N2/CO2(80/20，V/V)曝氣40 min后鋁蓋密封，121 °C滅菌30 min后冷卻到室溫待用。制備好的培養(yǎng)基通過接種氣路用1 mL注射器加入0.75 mL微量微生素溶液、0.5 mL還原劑(100 mmol/L L-Cysteine 和 50 mmol/L的Na2S混合溶液)及0.5 mL乙醇溶液(2 mol/L)，厭氧氣路接種M.barkeri與G.grbiciae構(gòu)成的混合微生物(10%接種量，V/V)后置于37 °C下培養(yǎng)。利用氣相色譜定期檢測厭氧瓶中甲烷的濃度。厭氧瓶中甲烷的濃度隨時間變化如圖7所示，接種培養(yǎng)64天后厭氧瓶中甲烷的量達1.45±0.03 mmol(±SD,n=3)，這說明使用自制實驗室多功能厭氧微生物接種及培養(yǎng)裝置成功地培養(yǎng)了G.grbiciae與M.barkeri的co-culture。G.grbiciae與M.barkeri都為嚴格厭氧微生物，而兩種微生物在自制的裝置中都能生長，這充分說明了該裝置在嚴格厭氧微生物的接種及培養(yǎng)時的有效性。

圖7G.grbiciae與M.barkeri的co-cultures耦合代謝乙醇產(chǎn)甲烷

3　結(jié)　語

本文設(shè)計與制備了實驗室簡易厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種與培養(yǎng)裝置，并將該裝置用于嚴格厭氧微生物GeobactersulfurreducensPCA、Geobactergrbiciae及Methanosarcinabarkeri800的培養(yǎng)基制備、接種與培養(yǎng)。實驗結(jié)果表明，該裝置完全滿足試驗要求，且具有原料易得、制作簡單、成本低及使用靈活等優(yōu)點。該裝置還適用于批量厭氧培養(yǎng)基的制備、厭氧接種及厭氧微生物的培養(yǎng)，在為我?！拔⑸飳W(xué)”“環(huán)境微生物技術(shù)”及“發(fā)酵工程”的實驗教學(xué)構(gòu)建了新的實驗平臺，并取得了良好的效果。實驗室簡易厭氧微生物培養(yǎng)基制備、接種與培養(yǎng)裝置的成功設(shè)計與制造，不僅改善了學(xué)校的實驗教學(xué)條件，更重要地是引導(dǎo)學(xué)生將所學(xué)的金工、機械制圖、AutoCAD、化工原理及生物等知識有機結(jié)合后應(yīng)用到一個具體工程項目，有助于培養(yǎng)和提高學(xué)生的協(xié)同合作、查閱文獻、實驗探索、工程實踐及科技創(chuàng)新能力，最終達到培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新意識、創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力的目的。

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