青貯用拮抗黃曲霉并降解黃曲霉毒素菌株的篩選與鑒定

張舒月，鄭婧萱，郭曉軍，薛曉華，李銘雪，朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北保定 071000）

青貯飼料中黃曲?霉毒素的污染是一個全球性問題，為青貯飼料中霉菌毒素評定的主要指標（孟慶祥等，2016）。 其中黃曲霉毒素 B1（AFB1）被世界衛(wèi)生組織列為毒物之首，定為IA類致癌物質(zhì)，給動物生產(chǎn)性能和人類健康帶來巨大的威脅 （喬宏興等，2017）。因此，青貯飼料中黃曲霉毒素的去除是反芻動物養(yǎng)殖者和科研機構(gòu)重點關(guān)注的內(nèi)容。

黃曲霉毒素常見的脫毒方法包括物理法、化學法和生物法。但是理化方法會對青貯飼料的質(zhì)量和營養(yǎng)有不同程度的影響，甚至會引起污染。相較之下生物法應(yīng)是最優(yōu)的選擇，生物脫毒主要有酶解法和微生物發(fā)酵法。酶解法近年來研究較多，但微生物降解酶的機理不明確、分離純化過程復雜、酶的活性不穩(wěn)定、酶作用條件苛刻等，難以在實際生產(chǎn)中推廣和應(yīng)用（計成等，2010）。目前，微生物法降解黃曲霉毒素已成為研究的熱點，但主要集中在利用微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進行脫毒，而通過生物競爭原理抑制黃曲霉生長從而降低霉菌毒素的產(chǎn)生和積累研究相對較少。由于黃曲霉毒素既可在作物田間生長時產(chǎn)生也可在倉儲期間產(chǎn)生，所以如果篩選到拮抗黃曲霉生長并且降解黃曲霉毒素的雙功能菌株，在青貯飼料中黃曲霉毒素的脫毒方面將具有很好的應(yīng)用前景。

本試驗擬通過平板擴散法和酶聯(lián)免疫法篩選拮抗黃曲霉生長且降解黃曲霉毒素的菌株，并對活性較高的菌株進行性質(zhì)研究和種屬鑒定，為新型青貯劑的研制提供更多的毒素降解微生物種質(zhì)資源。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品牛糞、全株玉米青貯、土壤、牛奶、實驗室保存的菌株等。

1.1.2試驗菌株黃曲霉（Aspergillus flavus），由河北農(nóng)業(yè)大學真菌毒素與分子病理學實驗室提供。

1.1.3培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉8.5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、葡萄糖 1 g/L，pH 6.5

香 豆 素 培 養(yǎng) 基 ：KH2PO40.25 g/L、MgSO40.205 g/L、KNO30.5 g/L、 （NH4）2SO40.5g/L、CaCl20.004 g/L、FeCl30.002 g/L，pH 7.0， 加入 1 g 香豆素，固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂粉。

1.1.4試劑香豆素，COOLABER科技有限公司；黃曲霉毒素標準品，美國Sigma公司；黃曲霉毒素試劑盒，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；PCR相關(guān)試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1菌株的分離稱取土壤、牛糞等樣品各10.0 g，分別加到裝有100mL無菌水的三角瓶中，放于37℃，180 r/min搖床中30min。吸取混勻后的溶液1.0mL于裝有9.0mL無菌水的試管中，用漩渦振蕩儀混勻，將混勻液逐級稀釋至10-7濃度。

分別吸取各種樣品稀釋度為10-5～10-7的溶液100μL均勻涂布在NA培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24 h后挑選菌落形態(tài)各不相同的單菌落劃線從而進一步純化，培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)并編號記錄，挑選單菌落接種至相應(yīng)的斜面，置于4℃冰箱中保存。

1.2.2菌株初篩挑取保存在斜面上的菌株，分別點接在香豆素培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，如有菌落長出，則在香豆素培養(yǎng)基上傳代3次，如傳代3次仍生長，則記錄該菌株編號，進入后續(xù)試驗。

1.2.3菌株復篩制作病原菌平板，待平板凝固后，使用直徑為1 cm的打孔器打孔。將初篩得到的菌株分別接種至NB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)12 h，以5%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h。 取發(fā)酵液1.5mL，10000 r/min離心 10min，取上清液80μL注入病原菌平板的孔中，放在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察是否有抑菌圈的出現(xiàn)，并記錄抑菌圈的直徑。

選擇抑菌圈直徑較大的菌株接種NB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)接到含AFB110μg/mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 d。通過酶聯(lián)免疫試劑盒檢測發(fā)酵液中剩余的AFB1濃度，并計算AFB1降解率。

1.2.4菌株的鑒定

1.2.4.1菌株的形態(tài)學鑒定對菌落大小、菌落顏色、菌落質(zhì)地、菌落邊緣等特征進行鑒別。

1.2.4.2菌株的分子生物學鑒定利用PCR技術(shù)對菌落16S rDNA進行擴增，并將純化的PCR產(chǎn)物送測序公司進行測序分析。將測序結(jié)果用BLAST軟件與GenBank中已登錄的16S rRNA基因序列進行同源性比較，通過CLUSTALX和BIOEDIT等軟件進行多重序列比對分析，并以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（王偉等，2014）。

1.2.4.3菌株的生理生化試驗根據(jù)16S rDNA序列分析的結(jié)果，對供試菌株進行生理生化試驗，包括硝酸鹽還原、厭氧生長、淀粉水解、明膠液化、V-P測定、D-甘露醇發(fā)酵和丙酸鹽利用等。

1.2.5菌株的性質(zhì)研究

1.2.5.1菌株的pH耐受性制備種子液，按6.0%的接種量接種于 pH 分別為 3.5、4.5、5.5、6.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 d后，測定菌株的生物量。

1.2.5.2菌株的溫度耐受性制備種子液，按6.0%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在17、27、37、47 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng) 2 d后， 測定菌株的生物量。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株的分離及初篩共分離得到120株菌，其中45株菌可以在以香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。

2.2黃曲霉拮抗試驗病原菌平板擴散法顯示初篩獲得的45株菌中有20株菌有抑菌圈。將抑菌圈的大小作為抑菌能力強弱的評判標準，通過量取透明圈的直徑，共得到拮抗活性較高的菌株11株，如表1所示。

表1　菌株抑菌圈大小

2.3黃曲霉毒素降解試驗通過酶聯(lián)免疫試劑盒測定11株菌對AFB1的降解率，結(jié)果見表2。11株拮抗菌株對AFB1的降解率集中在60%～95%，N-1a的降解率最高，為95%。故選擇該菌株作為待測菌株進行下一步試驗。

表2　菌株對AFB1的降解率%

2.4菌株的種屬鑒定

2.4.1菌株的形態(tài)學鑒定菌株N-1a的菌落形態(tài)呈中間微凹狀，四周隆起，乳白色，不透明。菌體呈直桿狀，常以鏈狀排列，革蘭氏染色呈陽性，存在運動性，無莢膜，芽孢呈橢圓形。

2.4.2菌株的分子生物學鑒定將菌株N-1a的16S rDNA序列與GenBank中所有已測定的原核生物的16S rDNA序列進行比對，使用PHYLIP program package軟件處理所得數(shù)據(jù)，得到了該菌株及相應(yīng)標準菌株的進化距離并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。由比對結(jié)果可知，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚到了一起。

圖1　基于16S rDNA序列同源性的菌株N-1a的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.3菌株的生理生化鑒定由于在系統(tǒng)發(fā)育樹中N-1a與枯草芽孢桿菌聚到了一起，故選擇枯草芽孢桿菌相關(guān)的項目進行生理生化試驗，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，菌株N-1a與枯草芽孢桿菌生理生化結(jié)果相一致，結(jié)合細菌菌落菌體形態(tài)和16S rDNA序列分析結(jié)果最終判定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.5性質(zhì)研究

2.5.1pH耐受性菌株N-1a在pH為 6.5、5.5、4.5和3.5時呈現(xiàn)不同的生長情況，如圖2所示，隨著pH的降低菌體濃度略有降低，但在pH為3.5時菌體濃度仍可達到108cfu/mL，表明該菌株具有較強的耐酸能力。

表3　生理生化試驗結(jié)果

圖2　菌株的pH耐受性

2.5.2溫度耐受性菌株 N-1a在 17、27、37℃和47℃均能生長，這樣就能滿足南北方不同氣溫下的青貯試驗。如圖3所示，菌株N-1a在37℃時生長量達到最高值，在27℃和47℃時菌體濃度仍能達到108～109cfu/mL。

圖3　菌株的溫度耐受性

3　討論

Gonzalez等（2008）報道，玉米青貯前的霉菌含量超過了104cfu/mL，其中，污染類型以曲霉屬為主，這與Keller等（2012）研究青貯飼料樣品中霉菌污染情況一致。目前黃曲霉毒素對食品和飼料危害極其嚴重，然而在去除方法中，物理、化學脫毒的方法存在營養(yǎng)成分流失，脫毒不徹底的缺點。本研究采用微生物法，不僅避免了這些缺點，而且條件溫和、安全環(huán)保，國內(nèi)外研究表明微生物脫毒法擁有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。

由于黃曲霉毒素毒性較大，若直接用于篩選菌株，可能會威脅到人體的健康，而且黃曲霉毒素價格也相對較貴，所以本試驗采用與其結(jié)構(gòu)相似的香豆素為唯一碳源進行菌株的初篩。相比而言，香豆素的毒性較低，價格較低廉。李超波等（2012）利用此法篩選到10株能夠在香豆素平板上正常生長的降解黃曲霉毒素的菌株，戴軍等（2014）利用此法篩選得到27株高效降解毒素的菌株。所以香豆素作為初篩底物來篩選降解黃曲霉毒素的菌株，不僅毒性大大減弱，而且方便準確。

近年來已有利用黑曲霉（李冰等，2012）、枯草芽孢桿菌（孫玲玉，2014）、施氏假單胞菌F4（李超波等，2012）降解黃曲霉毒素的報道，但是降解率大多都集中在85%左右。本研究篩選到的菌株N-1a對黃曲霉毒素的降解率達到95%，優(yōu)于先前其他研究。本試驗菌株N-1a經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，為國家飼料添加劑目錄中的安全菌株，并且該菌株還具有對黃曲霉的拮抗活性，應(yīng)用于青貯時可以達到對黃曲霉毒素防治結(jié)合的效果。

品質(zhì)好的青貯玉米在青貯過程中pH會降低到4.0以下，北方地區(qū)進行玉米青貯時，秋季溫度會低于20℃，故青貯菌株應(yīng)具有耐低pH、耐高低溫的性質(zhì)。本試驗篩選菌株N-1a在pH 3.5及溫度為17℃和47℃時生長情況均良好，是一株潛在的微生物青貯菌劑。

4　結(jié)論

本試驗獲得一株具有較高拮抗黃曲霉、降解黃曲霉毒素活性的枯草芽孢桿菌菌株，該菌株在pH 3.5～6.5和溫度17～47℃時生長情況均良好。

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