基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的四逆湯抗心肌缺血損傷的分子機制研究△

張歡歡，劉寒，向凈勻，吳杰，高原雪，何林，李敏，王斌

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西　咸陽　712046)

缺血性心臟病(Ischemic heart disease，IHD)是目前威脅人類生命健康的主要原因之一[1]。急性冠狀動脈閉塞所致的急性心肌梗死是缺血性心臟病中非常嚴重的一類疾病，立即恢復(fù)中斷的血液供應(yīng)是挽救瀕臨死亡心肌的關(guān)鍵所在。然而，心肌持續(xù)一段時間缺血后重新恢復(fù)血流灌注會導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)和功能的損傷加重，即產(chǎn)生缺血再灌注損傷(Ischemia/Reperfusion，I/R)。I/R能導(dǎo)致心肌細胞缺血損傷、血管功能異常和心力衰竭，甚至可導(dǎo)致猝死。研究發(fā)現(xiàn)，I/R加重心肌損傷可能與細胞內(nèi)鈣超載、氧自由基釋放、心肌能量代謝障礙、中性粒細胞浸潤、血管內(nèi)皮細胞損傷和細胞凋亡等有關(guān)，但具體機制尚未完全闡明[1-2]。

四逆湯是《傷寒論》的經(jīng)典要方，主要由淡附片、干姜、炙甘草以3∶2∶3比例組成。具有溫中驅(qū)寒、回陽救逆之功效，用于陽虛欲絕、冷汗、四肢厥逆、下利清谷、脈微欲絕等癥。現(xiàn)代臨床療效觀察和動物實驗研究均表明，四逆湯在心腦血管疾病的預(yù)防和臨床治療中療效顯著，尤其對心肌缺血損傷療效確切[3]。雖然目前對四逆湯藥理作用研究報道較多，但作用機制和配伍規(guī)律研究不夠系統(tǒng)和全面，本實驗運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對四逆湯抗心肌缺血作用機制和配伍規(guī)律進行預(yù)測分析，以期為中藥復(fù)方作用機制和配伍規(guī)律研究提供參考。

1　研究方法

1.1 四逆湯中候選活性化合物的收集與篩選

在傳統(tǒng)中藥數(shù)據(jù)庫TCMSP[4](http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中收錄四逆湯相關(guān)的活性化合物的基礎(chǔ)上，筆者結(jié)合TCMID(http：//www.megabionet.org/tcmid/)及TCM-PTD(http：//tcm.zju.edu.cn/)等數(shù)據(jù)庫收集四逆湯中的主要化學(xué)成分，通過文獻挖掘并利用TCMSP和Pub Chem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)等平臺對每一個活性化合物的分子結(jié)構(gòu)進行確證，最后將化合物統(tǒng)一保存為mol2格式或sdf格式文件。利用TCMSP數(shù)據(jù)平臺，對主要化合物成分的藥物動力學(xué)(Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME)性質(zhì)進行評估，選取同時滿足口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥40%和類藥性(Drug-Likeness，DL)≥0.18的化學(xué)成分作為候選活性成分。其中OB與生物利用度直接關(guān)聯(lián)；DL是指待測分子與藥物分子的相似度，即成為藥物的可能性。

1.2 潛在靶點的預(yù)測

對接得分(Z-score)代表活性成分與蛋白質(zhì)的相互作用強度。DRAR-CPI服務(wù)器(https：//cpi.bio-x.cn/drar/)采用雙向Z-變換函數(shù)轉(zhuǎn)換成Z分數(shù)從而提高預(yù)測準確性，服務(wù)器建議選取藥物分子與蛋白質(zhì)相互作用(chemical-protein)的Z-score<-0.5納入為潛在靶點。因此，登陸服務(wù)器上傳篩選得到的四逆湯候選活性分子的mol2格式或sdf格式文件。下載計算結(jié)果，為進一步縮小范圍和提高預(yù)測準確度，蛋白靶點納入標準設(shè)為Z-score<-1。將篩選得到的蛋白靶點的PDBID導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)，經(jīng)過檢索和轉(zhuǎn)化操作得到四逆湯成分的基因靶點。

1.3 心肌缺血疾病相關(guān)靶點的收集

從DisGeNET(http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)和CTD(http：//ctd.mdibl.org/)數(shù)據(jù)庫中收集抗心肌缺血損傷藥物作用靶點，并結(jié)合文獻挖掘的方法建立心肌缺血損傷疾病相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫。

1.4 活性成分-抗心肌缺血損傷靶點的篩選

將上述收錄的四逆湯共同作用靶點與心肌缺血疾病相關(guān)靶點進行比對分析，歸納總結(jié)出具有明確抗心肌缺血作用的預(yù)測靶點，最終建立四逆湯抗心肌缺血損傷作用靶點基因庫。

1.5 蛋白與基因信息校正

由于檢索到的靶點可能存在命名不規(guī)范或包含來源于不同物種的蛋白或基因，因此，上述每一步靶點的收集后都需要對靶點信息進行規(guī)范化處理。具體方法如下：采用 UniProt數(shù)據(jù)庫中UniProtKB搜索功能，輸入蛋白名稱(protein name)并限定物種為人(Homo sapiens)，將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱(Official Symbol)并摘錄標準基因名，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，獲取正確的靶點信息。

1.6 基因分析與通路注釋

本實驗應(yīng)用MAS 3.0(http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/)生物分子功能注釋系統(tǒng)對四逆湯抗心肌缺血損傷的共同作用靶點進行基因功能分析和KEGG通路注釋，將四逆湯調(diào)控靶蛋白對應(yīng)的基因直接映射到通路上，藥物靶點富集出的通路被認為是藥物調(diào)控的通路，參數(shù)設(shè)置見表1。

表1　基因富集分析參數(shù)設(shè)置

1.7 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將四逆湯中篩選出的共同作用靶點(基因)與富集得到的通路作為網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(node)，在Excel表格中建立相互對應(yīng)關(guān)系作為網(wǎng)絡(luò)的連接(edge)，導(dǎo)入Cytoscape 3.3.0軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，network analyzer插件進行網(wǎng)絡(luò)度(degree)、介數(shù)(betweenness)等網(wǎng)絡(luò)互作分析。從四逆湯-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖(Compound-Target-Pathway網(wǎng)絡(luò)圖)分析四逆湯抗心肌缺血的共同作用靶點，并明確藥物與通路之間的協(xié)同作用或疊加作用。

2　結(jié)果

2.1 四逆湯活性成分篩選結(jié)果

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中建立四逆湯口服易吸收的化合物庫，分別以附子、干姜、甘草為檢索詞，在數(shù)據(jù)庫中分別檢索到64、148、280個小分子化合物，去除重復(fù)的小分子化合物，然后依據(jù)OB≥40%，DL≥0.18為篩選標準對化合物進行二次篩選，將數(shù)據(jù)庫中具有較高活性的化合物篩選出來，分別得到11、2、70共83個化合物。

化合物的補充：考慮到化合物含量、代謝及藥理作用對四逆湯有效化合物進行補充。淡附片為四逆湯的君藥，其主要成分為生物堿類，所以在選取化合物中再加入deoxyaconitine、Aconitine、hypaconitine、Mesaconitine[5]到篩選得到的11個化合物中。干姜為四逆湯的臣藥，主要含有揮發(fā)油類成分及姜辣素成分，因此加入zingiberol、zingiberene、(10)-Gingerol[6]、(8)-Gingerol、4-Gingerol、[5]-gingerol、12-姜酚[6](12-Gingerol)、6-姜酚[7](6-gingerol)。而甘草為四逆湯的佐藥，其主要成分為甘草酸、甘草苷等，因此加入Glycyram、glabrolide、isoglabrolide、neoisoliquiritin、18β-glycyrrhetinic acid和β-Glycyrrhetinic acid。

基于以上分析研究，附子加入4個相關(guān)化合物，干姜加入8個化合物，甘草加入6個化合物，共計獲得101個小分子化合物，其中附子及甘草中各有1個化合物沒有預(yù)測到相關(guān)靶點，故僅總結(jié)保留的99個化合物信息。結(jié)果見表2。

2.2 四逆湯抗心肌缺血相關(guān)靶點信息

將從TCMSP、TCMID及TCM-PTD并結(jié)合文獻挖掘方法收集到的基因整理，刪除重復(fù)項，共得313個相關(guān)靶點；采用DisGeNET和CTD數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻挖掘方法搜尋與心肌缺血相關(guān)作用靶點共818個，建立心肌缺血損傷疾病靶點庫；將收集到的四逆湯基因與疾病靶點比對分析，歸納總結(jié)出預(yù)測靶點中有明確抗心肌缺血損傷作用的靶點91個，91個靶點信息見表3。

表2　四逆湯組成成分的化學(xué)信息和網(wǎng)絡(luò)參數(shù)

表2(續(xù))

表2(續(xù))

注：Caco-2是一種藥物離體口服特性篩選細胞模型，了解和評價藥物吸收機制；BBB是了解和評估活性成分進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)能力的指標。

表3　四逆湯抗心肌缺血相關(guān)靶點信息

表3(續(xù))

2.3 四逆湯抗心肌缺血相關(guān)靶點基因分析與通路注釋

將預(yù)測出的91個作用靶點通過MAS 3.0生物分子功能注釋系統(tǒng)對獲取靶點信息進行GO基因富集分析和 KEGG 靶點通路注釋分析。GO基因富集分析是跨越原核以及真核等多個物種的基因功能分類體系，它分別在生物學(xué)過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細胞組件(cellular component)3個細胞生物學(xué)領(lǐng)域?qū)︻A(yù)測靶點的基因及其產(chǎn)物進行功能定義分析。四逆湯抗心肌缺血的91個潛在作用靶點的GO分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)見圖1，在生物學(xué)過程分析中，蛋白水解(21個靶點)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(18個靶點)、氧化還原(16個靶點)、炎癥反應(yīng)及脂代謝(9個靶點)排列靠前，其同時還與血壓調(diào)節(jié)、抗凋亡等生物學(xué)過程有關(guān)；在分子功能分析中，蛋白結(jié)合(39個靶點)、金屬離子結(jié)合(23個靶點)、肽酶活性(21個靶點)、鋅離子結(jié)合(21個靶點)、氧化還原酶活性(16個靶點)、轉(zhuǎn)移酶活性(15個靶點)及鈣離子結(jié)合(13個靶點)排列靠前，其同時還與絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、細胞因子活性、NADP結(jié)合及受體活性有關(guān)；細胞組件成分分析發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)(47個靶點)所占比例最大。通過以上分析，反映心肌缺血涉及體內(nèi)多個生物過程且與多種蛋白結(jié)合、酶活性等有關(guān)，同時表明四逆湯通過改善這些生物過程發(fā)揮其抗心肌缺血作用。

注：A.生物過程；B.分子功能；C.細胞組分。圖1　預(yù)測靶點的GO富集分析生物過程、分子功能和細胞組分

通過KEGG基因注釋功能分析91個相關(guān)靶點富集映射出122條信號通路(見圖2)，23條直接或間接與心肌缺血有關(guān)，其中與炎癥反應(yīng)相關(guān)的有9條，分別是Cytokine-cytokine receptor interaction、Toll-like receptor、MAPK、TGF-beta、Jak-STAT、Arachidonic acid metabolism、Focal adhesion、Fc epsilon RI、Cell adhesion molecules(CAMs)信號通路；與細胞凋亡相關(guān)的信號通路有8條，分別是VEGF、Apoptosis、Gap junction、ErbB、Fc epsilon RI、p53、Glutathione metabolism、Regulation of autophagy信號通路；與心臟功能相關(guān)的信號通路有4條，分別是Calcium、Fc epsilon RI、Renin-angiotensin system、Regulation of actin cytoskeleton信號通路；與血管和血小板聚集有關(guān)的信號通路有7條，分別是Complement and coagulation cascades、Jak-STAT、Renin-angiotensin system、Fc epsilon RI、Arachidonic acid metabolism、Complement and coagulation cascades、Cell adhesion molecules(CAMs)信號通路。其中9個靶點參與補體系統(tǒng)信號通路的調(diào)節(jié)，7個靶點參與調(diào)節(jié)細胞因子-細胞因子受體相互作用和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，四逆湯主要活性成分的作用靶點分布于不同的代謝通路，相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)節(jié)是其抗心肌缺血的可能作用機制。

2.4 四逆湯-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與互作分析

利用Cytoscape 3.3.0軟件，建立“四逆湯藥物-分子-靶點-信號通路”圖(見圖3)，直觀展現(xiàn)四逆湯41個共同作用靶點與23條作用通路與心肌缺血疾病之間的關(guān)系。分析結(jié)果表明，補體系統(tǒng)、細胞因子及MAPK信號通路排位靠前，是網(wǎng)絡(luò)中的樞紐節(jié)點，其還可以通過Toll-like receptor、VEGF、TGF-β等信號通路發(fā)揮作用。另外Toll-like receptor和Apoptosis信號通路節(jié)點相對靠前，提示四逆湯可能通過調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)、炎癥、細胞凋亡、心血管功能等通路發(fā)揮協(xié)同作用。

通過網(wǎng)絡(luò)分析計算具體節(jié)點的拓撲學(xué)特征，能夠幫助我們從復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中獲得潛在的生物學(xué)信息。在生成的網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點代表藥效分子、靶標、通路，邊代表藥效分子-靶標-通路間的相互作用。為了說明節(jié)點的重要性以及節(jié)點如何影響兩個節(jié)點之間的信息交流，我們計算了網(wǎng)絡(luò)的兩個關(guān)鍵拓撲參數(shù)：網(wǎng)絡(luò)度(degree)和介數(shù)(betweenness)，見表4～6。

圖2　預(yù)測靶點的KEGG富集通路分析

注：●中藥干姜、附子和甘草；▲中藥活性化合物；活性化合物作用的相關(guān)靶點；■活性化合物富集得到的通路圖3　四逆湯藥物-分子-靶點-信號通路圖

表4　藥物-分子-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖中主要活性化合物拓撲學(xué)參數(shù)

表4(續(xù))

注：表中選取網(wǎng)絡(luò)度大于平均值6.63的化合物。

表5　藥物-分子-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)鍵靶點拓撲學(xué)參數(shù)

注：表中選取網(wǎng)絡(luò)度大于平均值14.41的靶點。

表6　藥物-分子-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖中主要通路拓撲學(xué)參數(shù)

注：表中選取網(wǎng)絡(luò)度大于平均值3.65的信號通路。

從圖3以及表4～6可以清楚看出四逆湯中3味中藥中重要化合物、靶點和信號通路情況，可以全面了解四逆湯中藥物活性成分發(fā)揮作用的主要機制。從表4看出附子中有9個化合物的degree值高于平均水平，干姜中的6-姜辣素、8-姜辣素5-姜辣素及12姜辣素的degree值均低于平均水平，僅有MOL002514_ Sexangularetin的degree值高于平均水平，而甘草中有22個化合物的degree值高于平均水平，且18β-glycyrrhetinic acid、glabrolide、Mairin位居前三。從表6看出，Complement、coagulation cascades、MAPK signaling pathway和Cytokine-cytokine receptor interaction位列前三，分別富集靶點9、7和7個，包括F10、SERPINE1、F13A1、SERPINA1、F9、PLG、F7、F2、PLAU、IL10、CX3CL1、HGF、IL6、IL4、AMH、TNFRSF1A、MAPK1、NTRK2、CASP3、AKT1、SOS1、PLA2G2A、TNFRSF1A共23個靶點，說明3味中藥更可能通過這3條信號通路發(fā)揮抗心肌缺血作用。

3　討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號節(jié)點進行多靶點藥物分子設(shè)計的新學(xué)科。研究表明，藥物與靶點之間傾向于組成富集的網(wǎng)絡(luò)，而不是孤立的一一對應(yīng)關(guān)系，大多數(shù)藥物通過多靶點發(fā)揮作用，而中藥作為一個系統(tǒng)，被認為是多靶點體系，但這種多靶點技術(shù)是建立在系統(tǒng)的思想和哲學(xué)方法上，其與系統(tǒng)生物學(xué)的哲學(xué)思想有一定的相似之處。臨床上的多種慢性病如腫瘤、心腦血管疾病等都是多基因、多因素作用的疾病，僅根據(jù)單一作用靶點難以達到良好治療的效果。而TCMSP是一個包含31 000多個化合物的中藥分子數(shù)據(jù)庫，其采用系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)來研究復(fù)雜的中藥體系，為中藥研究提供了新的思路和方法[8]。

文獻報道，四逆湯中的淡附片的主要成分為生物堿類、黃酮類、皂苷類等，已發(fā)現(xiàn)并鑒別的化學(xué)成分有122種，其中烏頭生物堿成分有105種，主要包括雙酯型、單酯型和醇胺型二萜類生物堿，這些生物堿對心血管系統(tǒng)的疾病療效顯著。干姜主要含有揮發(fā)油類成分及姜辣素成分，而炙甘草主要成分為三萜皂苷類、黃酮類化合物，其中甘草酸及其水解產(chǎn)物甘草次酸均為三萜皂苷類成分，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等療效。

近年來，大量的動物實驗和臨床應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)四逆湯在冠心病、心絞痛等方面具有良好的治療效果，這主要與四逆湯可以保護心肌、降低血壓、保護血管和免疫調(diào)節(jié)等作用有關(guān)[9-10]。四逆湯為配伍減毒方劑的代表，附子由于含有烏頭堿、新烏頭堿等而有劇毒，因此入方時需對其進行減毒處理。四逆湯中選用炙甘草和干姜對其進行配伍，使其毒性大大降低，并發(fā)揮了顯著療效。附子-甘草是配伍減毒的代表藥對，對其減毒機制研究主要集中在以下幾點：1)酸堿共沉淀。附子中的烏頭類生物堿與甘草中的甘草酸等酸性皂苷類成分，在共同煎煮后發(fā)生沉淀反應(yīng)，生成不溶于水的大分子絡(luò)合物，降低藥物毒性；2)甘草影響毒性成分在胃腸道的吸收過程。由于甘草具有誘導(dǎo)細胞色素P450的作用，加速了附子中生物堿成分的代謝而緩和了藥物毒性；3)甘草拮抗烏頭類生物堿毒性作用。甘草酸的水解產(chǎn)物葡萄糖醛酸可與烏頭類生物堿的羥基形成低毒或無毒的葡萄糖醛酸絡(luò)合物，經(jīng)尿液排出體外，發(fā)揮減毒作用。其還可通過調(diào)節(jié)糖酵解、脂質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)等代謝通路降低藥物毒性[11-12]。附子-干姜配伍，除了具有類似甘草的解毒作用外，還能夠通過誘導(dǎo)P-糖蛋白(P-gp)，從而抑制附子中雙酯型生物堿的吸收[11-13]。

四逆湯中的甘草和生姜不僅具有減毒作用，還具有協(xié)同增效作用。甘草對附子的增效作用主要表現(xiàn)在兩者各成分之間的協(xié)同作用。甘草與附子合用其強心作用增強，同時也具有對抗心律失常作用，這些作用與甘草中的甘草酸密不可分，但其協(xié)同的具體機理還需進一步探究。干姜對附子的增效作用主要是干姜與附子有相似的強心作用，同時干姜的主要活性成分姜酚能夠抑制細胞色素氧化酶P450(CYP450)含量及亞型 CYP2E1、CYP3A活性，能使附子中的有效成分代謝減少，從而發(fā)揮增效作用[11-14]。

綜合以上分析，四逆湯在體內(nèi)發(fā)揮作用是藥物拮抗減毒和協(xié)同增效的結(jié)果，本實驗應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對附子、干姜和甘草的共同作用靶點進行預(yù)測，結(jié)果顯示，補體系統(tǒng)[15-16]、細胞因子[17-18]及MAPK[19-20]信號通路是重要的中樞紐節(jié)點。補體系統(tǒng)是天然免疫的重要組成部分，參與抗感染與免疫調(diào)節(jié)，其激活后，補體蛋白經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)生成攻膜復(fù)合物(MAC、C5b-9)、C3a和C5a等補體成分，通過MAC的直接損傷及中性粒細胞的間接損傷作用，引起細胞損傷。細胞因子能夠參與和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，并能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。MAPK通路參與細胞生長、增殖和凋亡等生理過程，并影響神經(jīng)突觸可塑性。本次研究網(wǎng)絡(luò)分析及靶點代謝通路富集分析結(jié)果顯示：9個靶點參與補體系統(tǒng)信號通路的調(diào)節(jié)，7個靶點參與調(diào)節(jié)細胞因子-細胞因子受體相互作用和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，表明四逆湯可能通過補體系統(tǒng)、細胞因子及MAPK信號通路發(fā)揮抗心肌缺血作用。

綜上所述，四逆湯發(fā)揮抗心肌缺血的方式主要有調(diào)控補體系統(tǒng)、細胞因子及MAPK信號通路，也可以通過Toll-like receptor、VEGF、TGF-β等信號通路發(fā)揮作用。預(yù)測所得的活性成分、抗心肌缺血靶點揭示了四逆湯多成分、多靶點的協(xié)同抗心肌缺血的作用特點。同時本文采用的虛擬方法可應(yīng)用于類似中藥及復(fù)方的篩選研究；篩選出可能有效的成分，為后期植物藥的分離純化、結(jié)構(gòu)修飾和化學(xué)合成提供依據(jù)；篩選出抗心肌缺血的靶點、通路，為心肌缺血病的新藥研究和臨床治療提供參考。

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