肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用分析

吳萍萍，沈亭海，凌學(xué)士

（1.池州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽池州 247000；2.巢湖市畜牧獸醫(yī)局,安徽巢湖 238000；3.合肥市動(dòng)物疫病控制中心,安徽合肥 230000）

當(dāng)前，隨著生活方式的轉(zhuǎn)變，人們開始不斷追求更高的生活質(zhì)量，對牛奶和奶制品方面的需求呈上升趨勢，奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展逐漸向規(guī)?；?、集約化及現(xiàn)代化轉(zhuǎn)型。然而，飼養(yǎng)工業(yè)的發(fā)展問題、疾病防治手段及飼養(yǎng)管理水平方面的不良因素，空氣、水源等污染造成飼養(yǎng)環(huán)境中病原微生物的增多、奶牛發(fā)病率升高現(xiàn)象，同時(shí)癥狀較為復(fù)雜，甚至出現(xiàn)復(fù)合感染，致病因素由多種致病菌的共同作用取代了之前的單種因素。其中最為常見的疾病則是奶牛乳房炎，其發(fā)病機(jī)制是多種致病微生物共同作用，產(chǎn)生局部炎性病變。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，全世界患有乳房炎的奶牛在6000萬頭以上，由此每年會造成2000億元左右的損失，奶牛由此被淘汰的數(shù)量占據(jù)3%左右，而在我國，奶牛乳房炎的發(fā)病率在46.5%～85.6%，也就是說每一頭牛都會損失1200～3600元，產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失是巨大的。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，奶牛乳房炎對產(chǎn)奶量有不良影響，同時(shí)也會在一定程度上降低奶牛泌乳功能，造成淘汰結(jié)果，特別是隱性乳房炎，其特點(diǎn)為發(fā)病率高、隱蔽性強(qiáng)，不出現(xiàn)明顯的體征。另一方面，具有疾病的奶牛，其產(chǎn)出的奶質(zhì)量也會大幅度下降，對人們的生活健康形成威脅。

1　奶牛乳房炎病菌和癥狀分析

1.1奶牛乳房炎病菌 奶牛乳房炎作為當(dāng)前對世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生重大影響的嚴(yán)重疾病之一，主要病因是葡萄球菌、鏈球菌和腸道桿菌感染。當(dāng)前對奶牛乳房炎最為有效的治療方法是采用抗生素治療，然而，長期以來抗生素的濫用使奶牛乳房炎病菌逐漸出現(xiàn)了耐藥性，且發(fā)病率不斷增加，目前甚至發(fā)現(xiàn)超級耐藥菌株，增加奶牛乳房炎的臨床治療難度。

1.2奶牛乳房炎癥狀和診斷 奶牛乳房炎分為兩種，即臨床型乳房炎和隱性乳房炎。其中臨床型乳房炎癥狀非常明顯，肉眼能看出炎性變化、乳房腫脹及泌乳量降低，從而進(jìn)行診斷。被細(xì)菌感染的奶牛，其臨床癥狀體現(xiàn)為乳房局部存在炎性反應(yīng)、泌乳量呈現(xiàn)降低趨勢、食欲減退及精神抑郁；若為病毒感染，則表現(xiàn)為丘疹、水泡等，繼而造成細(xì)菌感染，出現(xiàn)乳房炎；若為真菌感染，其癥狀則為奶牛發(fā)熱、產(chǎn)奶量降低、乳腺出現(xiàn)肉芽腫樣組織變化。

隱性奶牛的診斷相對來說較為復(fù)雜，其中最為準(zhǔn)確的方式是對乳汁中的微生物進(jìn)行微生物學(xué)檢驗(yàn)，之后進(jìn)行病原微生物分離。一般來說，其步驟主要是病原微生物的分離和培養(yǎng)，鑒定其特性、形態(tài)和生理，之后采取針對性治療。用于檢測奶牛乳房炎最常用的方式為乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)也是奶牛健康評價(jià)指標(biāo)。

2　肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用

而肉桂醛作為肉桂科植物提取物的主要生物有效物質(zhì)，是一種單一的有機(jī)化合物。肉桂醛液體特征為無色或者淡黃色，具有很強(qiáng)的香氣，難溶于水，可與醇、醚相融，具有易氧化、揮發(fā)性質(zhì)，但對酸、堿不穩(wěn)定。肉桂醛在醫(yī)藥方面應(yīng)用較為廣泛，主要功能有殺菌消毒防腐；抗?jié)?、加?qiáng)胃腸道運(yùn)動(dòng)；促進(jìn)脂肪分解（涂小麗等，2015）；有效抗病毒、抗癌；有利于擴(kuò)張血管，并具有降壓作用等。一般在外用藥和合成藥中也較為常見。

2.1肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌作用的研究進(jìn)展 相關(guān)研究報(bào)道指出，造成奶牛乳房炎的致病微生物種類超過100種，有接觸類傳染病原菌、環(huán)境病原菌、細(xì)菌、病毒及真菌。其中接觸類傳染病原菌有沙門氏菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、金黃的葡萄球菌等；環(huán)境病原菌中有酵母菌、大腸桿菌、皰疹病毒等；細(xì)菌有表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌等，另外還有些產(chǎn)氣桿菌屬、克雷伯氏菌屬等；病毒有牛痘病毒牛乳頭炎、口蹄疫病毒等；真菌則有隱球菌屬、毛孢子菌屬等。除此之外還有一些支原體。

一些研究證實(shí)，肉桂醛可特異性對細(xì)菌細(xì)胞壁葡聚糖和幾丁質(zhì)的合成產(chǎn)生破壞作用，在損傷細(xì)胞壁后，對細(xì)胞內(nèi)的微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷作用，以達(dá)到消滅細(xì)菌的目的（陳玲玲等，2015）。肉桂醛可對大腸桿菌產(chǎn)生脅迫作用，使大腸桿菌細(xì)胞中存在過量的活性氧，升高超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活力，對細(xì)胞膜脂質(zhì)造成深度氧化損害，進(jìn)一步破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，消滅大腸桿菌。同時(shí)，肉桂醛在飼料行業(yè)中主要用于飼料添加劑使用，對畜禽生長發(fā)育起到促進(jìn)作用，并提升飼料轉(zhuǎn)化率；具有防治動(dòng)物感染性疾病作用，同時(shí)對飼料中的霉菌有抑制作用。在牛飼料中添加肉桂醛能充分發(fā)揮瘤胃改良劑的作用，提升養(yǎng)牛效益。程浩等（2017）充分利用肉桂醛的特點(diǎn)，即抑菌、低毒及可作為牛飼料添加劑，研究了對奶牛乳房炎主要病原菌的抑菌作用。

2.2肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌抑制作用的實(shí)驗(yàn)分析

2.2.1實(shí)驗(yàn)材料選擇 實(shí)驗(yàn)材料為金黃色葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌（E.coli）、無乳鏈球菌（S.agalactiae），自鮮乳樣中分離、純化、鑒定后獲?。贿x取標(biāo)準(zhǔn)菌種金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）和大腸桿菌（ATCC 43890）作為對照使用；營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；分析純選用無水乙醇；98%的肉桂醛溶液。

2.2.2配制菌液和藥液 取液氮中40%甘油保護(hù)的各個(gè)菌株儲備菌液100 μl，在相對應(yīng)的培養(yǎng)基中混勻；在對應(yīng)液體、固體培養(yǎng)基中連續(xù)劃線接種、擴(kuò)繁兩次，使菌株生命力保持旺盛。在無菌、37 ℃，200 r/min條件下，各菌株的單菌落在相對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中迅速生長，顯微鏡下用倍比稀釋法進(jìn)行計(jì)數(shù)，將菌液稀釋為1×108CFU/mL并冷藏；98%的肉桂醛稀釋時(shí)使用75%酒精1：9的比例進(jìn)行，將其濃度稀釋為741.5 mmol/L，并在-20 ℃的溫度下保存。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1對奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用

3.1.1對奶牛乳房炎主要致病菌的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）MIC的測定是利用各個(gè)菌株對應(yīng)的液體培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行，將菌株所對應(yīng)的液體培養(yǎng)基、肉桂醛、稀釋菌液分別加入滅菌試管中如表1，直至細(xì)菌為5×105CFU/mL，在溫度為37℃的環(huán)境下培養(yǎng)0.5～1 d；對試管中的液體進(jìn)行肉眼觀察，其透明、不分層及培養(yǎng)前的最小肉桂醛濃度作為MIC，同時(shí)需要保持在重復(fù)3次后MIC沒有產(chǎn)生變化。

3.1.2 對奶牛乳房炎主要致病菌生長的影響 采用生長曲線進(jìn)行觀察：在無菌條件下，分別選取相對應(yīng)的菌株固體培養(yǎng)基，將菌落放置在3 mL對應(yīng)的液體培養(yǎng)基試管中，之后放置在生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，保證無菌條件；再將培養(yǎng)后的3 mL培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到97 mL的液體培養(yǎng)基中，并使其在37 ℃、200 r/min條件下快速生長。然后將菌液分別放置在6個(gè)50 mL的三角錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中放置15 mL，且5個(gè)錐形瓶中肉桂醛的濃度分別為 1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、一個(gè)乙醇濃度為0.05%。將其在37 ℃、200 r/min 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并在 0、1、2、3、4、6、8、10、12 h對OD值進(jìn)行測量，得到相應(yīng)曲線。

3.2對奶牛乳房炎主要致病菌的殺滅作用

3.2.1對奶牛乳房炎主要致病菌的最小殺滅濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC） 程浩等（2017）的研究表明，肉桂醛可有效殺滅奶牛乳房炎主要致病菌，不同的致病菌所使用的濃度具有一定差異。本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最小殺滅濃度的研究，得出以下結(jié)果。

3.2.2對奶牛乳房炎主要致病菌殺菌的影響

同樣采用曲線進(jìn)行觀察，與以上處理相同，且5個(gè)錐形瓶中肉桂醛的濃度分別為1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MBC、2 MBC、一個(gè)乙醇濃度為 0.05%。取樣和稀釋的時(shí)間分別為 0、1、3、5、7、9、12、18 h，同樣采用平板法對活菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，之后得出曲線。

3.3結(jié)果

3.3.1肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌都能產(chǎn)生抑制，其中標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌的MIC為1.6 mmol/L，金黃的葡萄球菌的MIC為3.2 mmol/L；標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌的MIC為3.2 mmol/L，大腸桿菌MIC為6.4 mmol/L；鏈球菌MIC為1.6 mmol/L。其中，在對照組中加入最大劑量的稀釋劑后，并不會對奶牛乳房炎主要致病菌的生長產(chǎn)生影響（見圖 1～ 3）。

圖1　肉桂醛濃度對大腸桿菌生長曲線的影響

圖2　肉桂醛對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響

圖3　肉桂醛對大腸桿菌的殺菌曲線

肉桂醛的濃度為1/16 MIC、1/8 MIC時(shí)，對奶牛乳房炎主要致病菌無明顯影響；濃度為1/4 MIC、1/2 MIC時(shí)，主要致病菌生長滯后，證實(shí)在此濃度下可有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌。

3.3.2肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的殺滅作用 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌都可起到殺滅作用，其中標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌的MBC為12.8 mmol/L，金黃色葡萄球菌的MBC為25.6 mmol/L；標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌的MBC為12.8 mmol/L，大腸桿菌的MBC為25.6 mmol/L；鏈球菌MBC為12.8 mmol/L（見圖4～ 6）。

圖4　肉桂醛對大腸桿菌的殺菌曲線

圖5　肉桂醛對金黃色葡萄球菌的殺菌曲線

圖6　肉桂醛對無乳鏈球菌的殺菌曲線

添加0.05%乙醇、培養(yǎng)時(shí)間為7h時(shí)的測量結(jié)果顯示，各細(xì)菌數(shù)僅有所增長，且增長數(shù)量約為10倍左右。而添加肉桂醛且濃度為1/8 MBC時(shí)可產(chǎn)生較高的殺滅效果；濃度為1/4時(shí)無明顯殺滅作用；濃度為1/2 MBC時(shí)，18 h內(nèi)均無法完全殺滅細(xì)菌；濃度為1 MBC、2 MBC時(shí)，7 h內(nèi)能殺滅致病菌，且相比之下，2 MBC時(shí)殺菌效果較高。

肉桂醛的性質(zhì)主要有易氧化和揮發(fā)性，在與其他的物質(zhì)結(jié)合后，便于保存同時(shí)增強(qiáng)抑菌效果。本次實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果充分表明，肉桂醛的使用能有效抑制奶牛乳房炎主要致病菌，從抑制效果上看，明顯高于乙醇產(chǎn)生的效果；依照細(xì)菌耐藥性的標(biāo)準(zhǔn)（MBC≥32 MIC）能夠看出，奶牛乳房炎主要致病菌并沒有對肉桂醛產(chǎn)生耐藥性，充分說明肉桂醛是一種潛在的奶牛乳房炎臨床治療藥物，當(dāng)前研究已經(jīng)證實(shí)肉桂醛的使用可產(chǎn)生有效的抑菌效果，但仍需進(jìn)行深入研究。另外，也有些研究證實(shí)（胡飛等，2017），肉桂醛在植物提取肉桂油、檸檬醛、牛至油中使用能產(chǎn)生最佳的抑制效果，且相較于大腸桿菌的抑制效果，金黃色葡萄球菌的抑制效果較高。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯然與相關(guān)研究結(jié)果一致，且肉桂醛對鏈球菌產(chǎn)生的抑菌效果更大。

對于肉桂醛抑菌的作用機(jī)制，有些研究提出肉桂醛主要是對真菌和細(xì)菌結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生破壞，導(dǎo)致細(xì)菌死亡；也有些說法認(rèn)為肉桂醛進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部（盧楊柳，2016），并對基因的正常表達(dá)產(chǎn)生影響，同時(shí)還干擾細(xì)胞代謝，產(chǎn)生抑菌效果。

4　結(jié)語

養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展最重要是質(zhì)量和產(chǎn)量，面對當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展問題，應(yīng)積極尋找有效的改善方式。針對飼料中的安全和質(zhì)量問題，更應(yīng)與飼料行業(yè)合作，共同進(jìn)行研究，合理解決。在本文分析過程中明確指出，奶牛乳房炎主要致病菌可采用肉桂醛進(jìn)行抑制和殺滅，從而保障奶牛產(chǎn)量和質(zhì)量，效果之佳證實(shí)了在實(shí)際發(fā)展中的使用價(jià)值。綜上所述，應(yīng)合理使用肉桂醛，且添加在飼料中有利于奶牛產(chǎn)量和質(zhì)量提升，同時(shí)促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

[1]陳玲玲，玉柱，毛培勝，等.中國飼草產(chǎn)業(yè)發(fā)展概況及飼草料質(zhì)量安全現(xiàn)狀[J].飼料工業(yè)，2015，36（5）：56～60.

[2]程浩，周夢潔，胡飛，等.肉桂醛體外抑制奶牛乳房炎主要致病菌的研究[J].中國獸藥雜志，2017，51（3）：39～43.

[3]胡飛，程浩，葉蔥蔥，等.肉桂醛防治奶牛乳房炎的安全性評價(jià)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017，（12）：153 ～ 155.

[4]盧楊柳.肉桂醛對食源性致病菌的抑制動(dòng)力學(xué)模型及其作用機(jī)制[D].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[5]涂小麗，鐘芳，鄧伏清，等.微生物發(fā)酵飼料對生長豬生產(chǎn)性能和營養(yǎng)物質(zhì)利用率的影響[J].飼料工業(yè)，2015，36（4）：36～38.

[6]許女，史改玲，程宏乾，等.牛源乳酸菌的粘附特性及對奶牛乳房炎大腸桿菌的粘附抑制研究[J].中國食品學(xué)報(bào)，2017，17（1）：20～30.