仿生態(tài)栽培金線蓮的指紋圖譜與微量元素研究

張海燕

(福建省邵武市林業(yè)科技推廣中心，福建 邵武 354000)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)是一種名貴中藥材，具有較高的保健與藥用價(jià)值。隨著市場(chǎng)需求的不斷擴(kuò)大和野生資源的日益枯竭，組培和大棚種植成為商品金線蓮的主要來源[1]。由于人工培育金線蓮品質(zhì)較低，仿生態(tài)栽培金線蓮應(yīng)運(yùn)而生。通過模仿原生境的栽培模式，提高金線蓮藥用品質(zhì)，可以滿足“道地性”要求[2]。雖然已有多種中草藥的仿生態(tài)栽培獲得成功，但金線蓮仿生態(tài)栽培還處于嘗試階段。目前，仿生態(tài)栽培金線蓮的藥用品質(zhì)還不明確，無法與組培和大棚栽培金線蓮進(jìn)行準(zhǔn)確的比較，這在一定程度上影響了金線蓮仿生態(tài)栽培模式的推廣應(yīng)用和市場(chǎng)價(jià)格[3-5]。

長(zhǎng)期以來，金線蓮的品質(zhì)一般采用黃酮、氨基酸和多糖等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)判，難以反映中成藥中的復(fù)合成分及其綜合藥理機(jī)制[6]。近年來，化學(xué)指紋圖譜技術(shù)被應(yīng)用到中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)領(lǐng)域，結(jié)合多種分離技術(shù)的運(yùn)用和多元統(tǒng)計(jì)分析，能夠較為全面地評(píng)價(jià)中草藥質(zhì)量[7]。另外，微量元素是中草藥的重要組分，其含量及比例的高低直接影響中成藥的生物活性[8]，如中藥藥效成分天麻素活性與微量元素含量具有明顯相關(guān)性[9]，當(dāng)歸頭、身、尾分用異效與微量元素含量差異密切相關(guān)[10]。目前，有關(guān)利用指紋圖譜和微量元素對(duì)金線蓮進(jìn)行品質(zhì)分析的研究很少。本研究通過測(cè)定仿生態(tài)栽培過程中金線蓮HPLC指紋圖譜和微量元素含量變化，比較不同來源金線蓮品質(zhì)差異，可為金線蓮仿生態(tài)栽培、金線蓮品質(zhì)判定和制定仿生態(tài)栽培標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1　材料與方法

1.1　仿生態(tài)樣地設(shè)置與樣品采集

種植區(qū)位于邵武市二都國(guó)有林場(chǎng)，依據(jù)金線蓮生長(zhǎng)習(xí)性及其野生林地特征，選擇以米櫧為主的天然常綠闊葉林為栽培種植區(qū)。在林內(nèi)選擇腐殖質(zhì)豐富、土壤濕度較高的區(qū)域，設(shè)置5 m×5 m的種植樣地(種植密度約為160株·m-2)5塊。

于2016年4月移栽金線蓮組培苗(福建金線蓮尖葉種)，除模擬降雨噴灌及適度遮蔭外，無其它人工干預(yù)措施。并于當(dāng)年5月、6月、7月、9月共采集4批次金線蓮樣品(按時(shí)間順序分別記為S1、S2、S3、S4)。同時(shí)在邵武野外采集與仿生態(tài)栽培同一品種的野生金線蓮樣品(生長(zhǎng)1 a左右，記為S5)，另在市場(chǎng)上采購?fù)黄贩N的成品大棚種植金線蓮樣品(生長(zhǎng)240 d左右，記為S6)和成品組培金線蓮樣品(記為S7)。樣品采后進(jìn)行烘干處理，研磨后用于指紋圖譜和微量元素的測(cè)定，并采集樣地的表層(0～20 cm)土壤，烘干、過篩后用于測(cè)定微量元素。

1.2　指紋圖譜的分離

將金線蓮粉末用80%甲醇提取后通過高效液相色譜儀(安捷倫1260)分離金線蓮指紋圖譜，色譜柱使用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，色譜分離條件依據(jù)文獻(xiàn)[10-11]的方法，并做一定調(diào)整，檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm;流速1 mL ·min-1；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL(表1)。

1.3　微量元素的測(cè)定

采用硝酸-高氯酸法消解植物樣品[12]，然后利用 ICP-OES測(cè)定所有樣品中的B、Mn、Fe、Sr、Zn、Li的含量[12]，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。

表1　色譜條件

1.4　數(shù)據(jù)處理

用中藥色譜指紋圖譜的相似系統(tǒng)(2004 A版)計(jì)算軟件繪制色譜圖，用Excel 2007、DPS 7.5和SPSS 22.0等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和聚類分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　金線蓮指紋圖譜分析

不同仿生態(tài)栽培時(shí)間和不同栽培方式金線蓮的指紋圖譜見圖1。從圖1可以看出，隨著仿生態(tài)栽培時(shí)間的延長(zhǎng)(S1-S4)，金線蓮指紋圖譜發(fā)生了較大變化，以2、3、4、5、6、7、8號(hào)位的峰形變化較為明顯，至仿生態(tài)栽培150 d后，上述峰形面積大幅增長(zhǎng)，并最終與野生金線蓮譜圖類似。表明仿生態(tài)栽培改變了金線蓮中的有機(jī)組分，最終成分趨近于野生金線蓮，仿生態(tài)栽培對(duì)金線蓮品質(zhì)提高較為有效。仿生態(tài)栽培期間的金線蓮指紋圖譜變化較為復(fù)雜，但栽培100～150 d后其指紋譜圖逐步接近野生金線蓮，說明這一時(shí)期為仿生態(tài)金線蓮品質(zhì)變化的關(guān)鍵期。栽培150 d后譜圖與野生金線蓮最為相似，表明仿生態(tài)金線蓮的各有機(jī)組分比例與野生金線蓮類似。

圖1　不同金線蓮樣品HPLC指紋圖譜

進(jìn)一步比較組培、大棚種植、仿生態(tài)栽培150 d和野生金線蓮指紋圖譜可以看出，仿生態(tài)栽培150 d和野生金線蓮的指紋圖譜與其它栽培模式間存在明顯區(qū)別，其中1、2、3、5、6、7、8號(hào)位色譜峰面積差異顯著，說明盡管不同栽培模式下獲得的金線蓮中化學(xué)組分相似，但比例不盡相同。結(jié)合各時(shí)期仿生態(tài)栽培金線蓮指紋圖譜分析結(jié)果，2、3、4、5、6、7號(hào)位的色譜峰可提供仿生態(tài)金線蓮品質(zhì)判斷參考，除了野生金線蓮，它們?cè)谄渌鼧悠分泻勘壤汀?/p>

2.2　金線蓮微量元素含量分析

不同栽培方式下金線蓮中微量元素含量情況見表2。從表2可以看出，所有樣品中的微量元素含量均符合國(guó)家食品安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。仿生態(tài)栽培金線蓮中各種微量元素含量隨栽培時(shí)間延長(zhǎng)而增加，至仿生態(tài)栽培150 d，除了B元素外，最終含量都接近或超過野生金線蓮的水平。不同栽培方式的金線蓮中微量元素含量差異較大，除了B、Li和Mn外，其它元素均以野生金線蓮中含量為最高。且以Fe元素含量差異最顯著，野生金線蓮中Fe元素含量可達(dá)組培和大棚種植金線蓮的10倍以上。上述結(jié)果表明，金線蓮中微量元素含量與其生長(zhǎng)基質(zhì)密切相關(guān)。仿生態(tài)栽培能夠改變金線蓮中微量元素比例，其最終含量比例與其生物學(xué)特性和土壤性質(zhì)有關(guān)。

表2　不同金線蓮樣品微量元素含量　mg·kg-1

圖2　不同金線蓮樣品色譜圖聚類圖

2.3　指紋圖譜和微量元素的聚類分析

圖3　不同金線蓮樣品微量元素聚類圖

指紋圖譜聚類分析結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，仿生態(tài)栽培30 d金線蓮與組培苗最為接近；仿生態(tài)栽培60 d金線蓮與大棚種植金線蓮近似；仿生態(tài)栽培150 d金線蓮與野生金線蓮最為類似。微量元素的聚類分析見圖3。從圖3可以看出，組培與大棚種植金線蓮明確歸為一類，它們與野生金線蓮的相似度較低。仿生態(tài)栽培時(shí)間越長(zhǎng)，仿生態(tài)金線蓮與野生金線蓮的相似度越大。

3　結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，金線蓮?fù)ㄟ^150 d以上的仿生態(tài)栽培，其藥用品質(zhì)可達(dá)到或接近野生金線蓮水平。在金線蓮仿生態(tài)栽培過程中，相對(duì)于微量元素的變化，指紋圖譜的變化規(guī)律更為復(fù)雜，這可能與植物體中有機(jī)組分受多種因素的調(diào)控有關(guān)。因此仿生態(tài)金線蓮的質(zhì)量監(jiān)控應(yīng)結(jié)合多種指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定，才能全面反映仿生態(tài)金線蓮的品質(zhì)特征。金線蓮屬于多年生蘭科植物，每年10月期間開花，開花后藥用價(jià)值降低，因此為了實(shí)現(xiàn)其藥用品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益的最大化，建議每年3月種植訪生態(tài)金線蓮，9月采收金線蓮。

不同栽培方式間金線蓮的指紋圖譜和微量元素差異明顯，說明栽培環(huán)境對(duì)金線蓮藥用品質(zhì)的影響較大，通過結(jié)合多種方式進(jìn)行產(chǎn)品溯源是可行的。本研究中，雖然多個(gè)色譜峰被選定為仿生態(tài)金線蓮品質(zhì)評(píng)判參考，但其出峰時(shí)間與煙酸、蘆丁和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，未能判斷化合物具體種類。未來應(yīng)就此做進(jìn)一步分析鑒定，明確這些化合物在野生或仿生態(tài)金線蓮中的含量范圍。本研究表明野生或仿生態(tài)金線蓮中存在大量的Fe元素，明顯區(qū)別于其它種植方式，可作為本地野生或仿生態(tài)金線蓮一個(gè)特征的評(píng)判指標(biāo)，但評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)尚需做大量的研究工作。本研究?jī)H對(duì)金線蓮中6種微量元素進(jìn)行測(cè)定，今后需對(duì)更多的微量元素特征進(jìn)行研究，以期發(fā)現(xiàn)更多可用于鑒定不同條件生長(zhǎng)的金線蓮的明顯特征，為鑒定商品金線蓮的品質(zhì)提供有效的技術(shù)支撐。

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