代謝組學(xué)在腎毒性藥物評價中的應(yīng)用

夏天一　張　鳳　綜述　陳萬生　審校

代謝組學(xué)(metabolomics/metabonomics)是20世紀(jì)90年代興起的組學(xué)技術(shù)的重要分支，也是系統(tǒng)生物學(xué)(system biology)研究的組成部分[1]。代謝組學(xué)技術(shù)關(guān)注于生物體在多種內(nèi)外因素的作用下(遺傳變異、藥物作用、疾病影響、環(huán)境改變等)，內(nèi)源性小分子代謝物(分子量小于1 000)所表征的機體物質(zhì)、信息、能量代謝狀況改變[2]。由于上述變化位于生物信息流的末端，因而能夠放大上游基因組(genome)、轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)和蛋白組(proteome)的變化，并通過生物體的表型(phenotype)直觀表現(xiàn)出來。將小分子代謝物含量變化和病理、生理狀況聯(lián)系起來，通過組群分析的方式加以闡明，即可對疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸進行解釋[3]。代謝組學(xué)憑借其高通量、高靈敏度等特點，在藥物研究領(lǐng)域表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。Clayton等[4]于2006年提出了藥物代謝組學(xué)(pharmacometabolomics)的概念，即通過代謝組學(xué)的技術(shù)平臺，分析不同基因型和表現(xiàn)型個體在用藥前后的代謝表型和藥物反應(yīng)表型的相關(guān)性，進而對藥效和藥物毒性產(chǎn)生更加深入的了解。該技術(shù)能夠?qū)λ幬锏淖饔脵C制、作用范圍、作用靶點等進行表征，在藥物早期研發(fā)到臨床應(yīng)用的過程中具有得天獨厚的優(yōu)勢[5]。

藥物的毒理學(xué)研究是藥物代謝組學(xué)研究的重要領(lǐng)域，也是最早應(yīng)用的領(lǐng)域之一[6]。效、毒二重性幾乎是所有藥物的共性。一般而言，新藥的研發(fā)過程需要長達(dá)6～15年的時間，需要大量的人力、物力和財力投入，而僅有約0.01%～0.02%的藥物能夠通過長期安全性試驗和臨床試驗；藥物的毒性不良反應(yīng)也是藥物召回、下市的主要原因，是威脅人類健康的潛在殺手[7-8]。早期對藥物進行毒性評價，可以降低損害風(fēng)險、減少經(jīng)濟損失，使得資源得到更為有效的利用。腎臟是藥物毒性作用的重要靶器官。病因?qū)W研究認(rèn)為，毒性藥物及其代謝產(chǎn)物破壞腎小球、腎小管的正常結(jié)構(gòu)和功能，改變細(xì)胞內(nèi)外內(nèi)源性物質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，使代謝物水平發(fā)生紊亂，進而通過血液循環(huán)對靶組織或者靶器官產(chǎn)生影響，這種變化和藥物的濃度、分布等因素緊密相關(guān)[9]，可以運用代謝組學(xué)的方法實現(xiàn)宏觀把握與微觀分析。經(jīng)歷了十幾年的發(fā)展，代謝組學(xué)技術(shù)在實驗操作、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果詮釋等方面形成了系統(tǒng)的分析方法，通過生物標(biāo)志物鑒定、代謝途徑檢索、生物意義解析，能夠輔助探明腎毒性藥物的作用部位與作用機制。因此，本文旨在總結(jié)代謝組學(xué)技術(shù)在不同類型腎毒性藥物中的研究現(xiàn)狀，及其在腎毒性狀態(tài)下的關(guān)鍵代謝通路改變，以期為藥物腎毒性的早期預(yù)警(生物標(biāo)志物的探索)、藥物治療方案優(yōu)化和預(yù)后監(jiān)測提供參考。

代謝組學(xué)應(yīng)用于藥物腎毒性評價的優(yōu)勢

藥物腎毒性監(jiān)控是醫(yī)藥工作者長期關(guān)注的臨床問題，現(xiàn)有診斷往往通過病理學(xué)切片、生化指標(biāo)檢測對腎臟損傷情況進行評估。然而，病理切片具有高度的異質(zhì)性，作為一種損傷性的檢測手段，不適用于藥物腎毒性的早期監(jiān)測。同時，傳統(tǒng)腎臟功能評價指標(biāo)，如血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)等缺乏靈敏性。有研究表明，僅在腎功能下降50%時，SCr和BUN方產(chǎn)生可觀測變化；上述理化指標(biāo)易受到年齡、飲食、疾病等腎外因素的影響。

代謝組學(xué)研究因其系統(tǒng)性強、靈敏度高等特點相比于現(xiàn)有診斷方式展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。作為藥物腎毒性的有力評價手段，代謝組學(xué)具備如下特征：(1)實驗樣本“分析前”操作可靠。實驗樣本多為外周性生物樣本(如血液、尿液等)，組織侵襲性較小，對同一動物或者人體可以進行連續(xù)多次采集，用于把握藥物毒性的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸規(guī)律；樣本的采集、保存、前處理等操作規(guī)范化，能夠在保證樣本真實性的基礎(chǔ)上實現(xiàn)最大程度的有效生物信息提取[10]。(2)分析技術(shù)完善。近年來分析測試手段的完善為代謝組學(xué)準(zhǔn)確定性/定量研究提供了有力的保證。常用質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)等分析技術(shù)發(fā)展日趨成熟，可在簡單樣本“分析前操作”之后(氣相質(zhì)譜需要進行衍生化)，對樣本中多種小分子化合物進行快速、有效鑒別，對化學(xué)結(jié)構(gòu)、物質(zhì)含量等信息進行解析[11]。(3)數(shù)據(jù)分析精準(zhǔn)。從復(fù)雜的生物背景中提取重要的藥物毒性相關(guān)信息是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析重點。應(yīng)運而生的生物信息學(xué)，集生物、數(shù)學(xué)、計算機、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科研究之大成，為代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析提供了可靠的背景支持。運用邏輯回歸(LR)、隨機森林(RF)、支持向量機(SVM)、主成分分析(PCA)等機器學(xué)習(xí)方法，可以有效識別篩選藥物毒性發(fā)展過程中的代謝形態(tài)變化[12]；代謝相關(guān)數(shù)據(jù)庫(KEGG)可以輔助代謝產(chǎn)物的準(zhǔn)確判斷；生物背景定位可從基因、蛋白、酶等層次實現(xiàn)代謝譜變化的生物意義解析。

代謝組學(xué)在不同類型藥物腎毒性評價的應(yīng)用

氨基糖苷類藥物氨基糖苷類抗生素水溶性好、性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、殺菌能力強，被廣泛應(yīng)用于革蘭陰性菌感染及嚴(yán)重的復(fù)雜細(xì)菌性的感染治療。由于氨基糖苷類抗生素以原型排泄，通過細(xì)胞膜吞飲作用在腎皮質(zhì)聚集，從而引發(fā)腎毒性反應(yīng)。據(jù)文獻報道，慶大霉素和妥布霉素的腎毒性幾率高達(dá)14.0%和12.9%[13]。Sieber等[14]運用1H-NMR 和GC-MS的方法對慶大霉素腎病模型大鼠的血漿代謝譜進行分析，在考察不同用藥劑量和用藥時程后發(fā)現(xiàn)，腸道菌群相關(guān)代謝物變化明顯。同時，某些通過腎小管重吸收的物質(zhì)(如葡萄糖)含量有所下降，表明腎小管上皮細(xì)胞受到了實質(zhì)性的損害。即慶大霉素可能通過改變腸道菌群使得機體內(nèi)環(huán)境紊亂，并可直接在作用于腎小管上皮細(xì)胞造成腎損傷。

化療藥物順鉑是無機重金屬抗腫瘤藥，在體內(nèi)主要通過原型或DNA結(jié)合的形式排出。由于順鉑在腎臟中能夠長時間分布和高濃度蓄積，產(chǎn)生腎細(xì)胞毒效應(yīng)，改變離子蛋白酶活性，造成腎小管上皮細(xì)胞線粒體氧化損傷、自由基增多及相關(guān)凋亡等病理變化。Li等人通過快速液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(RRLC-QTOF/MS)的方法對順鉑誘導(dǎo)的SD大鼠腎損傷模型的血漿進行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)花生四烯酸、色氨酸等物質(zhì)的含量變化。上述研究指出，順鉑可導(dǎo)致腎臟的微炎癥狀態(tài)，并誘發(fā)免疫調(diào)節(jié)紊亂[15]。

鈣調(diào)磷酸酶抑制劑鈣調(diào)磷酸酶抑制劑主要包括環(huán)孢素(CsA)和他克莫司(Tac)，是肝臟、心臟、腎臟等實體器官移植后用于免疫抑制治療的基礎(chǔ)用藥，臨床效果良好，應(yīng)用廣泛。目前在腎移植術(shù)后，主要采用CsA或Tac與嗎替麥考酚酯(MMF)和潑尼松(Pred)三聯(lián)用藥的治療方案。而鈣調(diào)磷酸酶腎毒性是上述免疫治療方案的重點關(guān)注點。Lenz等[16]建立了CsA誘導(dǎo)的SD大鼠腎毒性模型，通過NMR測定尿中代謝產(chǎn)物含量，發(fā)現(xiàn)三甲胺等物質(zhì)含量有所上升，而三甲胺-N-氧化物的含量有所下降；通過HPLC-TOF/MS的數(shù)據(jù)分析得知，尿中黃尿酸、檸檬酸的含量下降，推斷上述化合物的變化可能與腎近曲小管損傷有關(guān)。

其他藥物除化學(xué)藥物腎毒性之外，代謝組學(xué)技術(shù)在中藥腎毒性研究中發(fā)揮了積極的作用。代謝組學(xué)統(tǒng)籌兼顧的特征與中藥“整合”的思想不謀而合，無論是中藥單體化合物、中藥提取物，還是配伍復(fù)方，其潛在腎毒性機制均能夠通過代謝組學(xué)的技術(shù)手段進行表征，并取得了初步的進展[17]。此外，代謝組學(xué)也為重金屬元素腎毒性的早期發(fā)掘提供了技術(shù)支持[18]。

藥物腎毒性關(guān)鍵代謝通路

氨基酸及生物胺類化合物腎臟在維持機體氨基酸池穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。腎臟參與氨基酸的合成、降解、濾過、重吸收和分泌等諸多生理過程。從定量角度來看，腎臟承擔(dān)50～70 g/d的氨基酸濾過，并有97%～98%被重吸收，從而實現(xiàn)血液循環(huán)氨基酸池與肌肉氨基酸池的中轉(zhuǎn)平衡[19]。腎臟損傷可導(dǎo)致多種氨基酸含量/比值發(fā)生改變。(1)苯丙氨酸-酪氨酸通路[20]：腎損傷導(dǎo)致由腎臟釋放的酪氨酸含量顯著下降；同時，苯丙氨酸水解成酪氨酸效率降低，因此，可觀測到酪氨酸/苯丙氨酸比值下降。(2)支鏈氨基酸代謝通路[21]：支鏈氨基酸(包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)參與機體的物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化過程。蛋白能量營養(yǎng)不良(PEM)是腎損傷常見并發(fā)癥，并繼發(fā)代謝性酸中毒。在該疾病狀態(tài)下，機體蛋白代謝呈現(xiàn)負(fù)氮平衡的狀態(tài)，支鏈氨基酸代謝限速酶-支鏈氨基酸脫氫酶活化，支鏈氨基酸含量下降，進一步抑制蛋白合成，促進分解代謝。(3)精氨酸代謝通路[22]：體內(nèi)10%～12% 的精氨酸由腎臟產(chǎn)生。精氨酸參與人體諸多生物學(xué)過程(一氧化氮、肌酐、胍丁胺、多胺合成，同時也是尿素循環(huán)的重要中間體)。多種研究表明，在腎損傷狀態(tài)下，精氨酸蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物對稱二甲基精氨酸(SDMA)和非對稱二甲基精氨酸(ADMA)含量顯著上升，抑制體內(nèi)一氧化氮合成，可作為腎損傷的生物標(biāo)志物。(4)含硫氨基酸代謝[23]：含硫氨基酸(甲硫氨酸、胱氨酸、半胱氨酸)在腎損傷狀態(tài)下的含量變化規(guī)律和腺苷高半胱氨酸(SAH)密切相關(guān)。由于腎臟是血漿SAH的主要調(diào)控器官，因而腎臟狀況能夠影響體液中含硫氨基酸的代謝。此外，藥物毒性往往造成細(xì)胞線粒體損傷，細(xì)胞氧化呼吸過程受阻，中心碳代謝(三羧酸循環(huán)、尿素代謝等)也受到阻礙[24]。

脂質(zhì)代謝部分小分子脂質(zhì)，如脂肪酸、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂等在腎臟的正常生命功能調(diào)節(jié)和疾病調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用[25]。多項研究證實，脂質(zhì)代謝在多種腎臟疾病中(如慢性腎臟病、腎小球腎炎、糖尿病腎病、移植腎病)中均有改變。在腎毒性藥物的刺激下，腎臟會發(fā)生氧化應(yīng)激、能量代謝、血液流變學(xué)等病理變化，和脂質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)相吻合。如20-羥二十烷四烯酸和環(huán)氧環(huán)氧-二十碳三烯酸被證實與多種腎損傷類型有關(guān)；神經(jīng)酰胺是腎損傷的獨立預(yù)測因子[26]。

代謝組學(xué)在藥物腎毒性評價的前景

科研工作者通過建立分析平臺、測試分析方法、追溯上游基因改變和代謝物響應(yīng)的情況，實現(xiàn)了一系列藥物腎毒性生物標(biāo)志物的篩選。借助于代謝組學(xué)技術(shù)，能夠輔助確定藥物的毒性機制、毒性靶組織、毒性劑量范圍，尋找特異性的毒性生物標(biāo)志物。

然而，在藥源性腎毒性的代謝組學(xué)研究中，尚且存在一些問題懸而未決：代謝產(chǎn)物、藥物劑量與腎臟病理改變的量化關(guān)系尚未建立；多數(shù)研究納入樣本不具有廣泛代表性，研究停留在動物模型水平；需要通過多中心大樣本臨床試驗克服性別、年齡、種族等因素引入的系統(tǒng)誤差；需要建立已知毒性代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)庫，以便在對未知藥物探索時進行比較；需要將代謝產(chǎn)物變化和病因?qū)W、藥物毒理學(xué)研究結(jié)合起來；需要對不同類型藥物的毒性生物標(biāo)志物、藥物腎毒性與其他腎臟疾病加以區(qū)分。目前英國倫敦大學(xué)的皇家科學(xué)院和Pfizer制藥公司等多個組織聯(lián)合于2001年建立了一個用于藥物毒性監(jiān)測的專家系統(tǒng)，即國際代謝組毒理學(xué)委員會(Consortium for Metabonomic Toxicology，COMET)，已對150多種肝腎毒性的藥物展開研究，而我國尚且缺乏類似系統(tǒng)的、集中化研究。

綜上所述，在代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)多組學(xué)整合，建立可靠的生物標(biāo)志物體系，才能全面系統(tǒng)地分析毒性物質(zhì)作用于腎臟后的基因表達(dá)改變、蛋白水平變化和組織水平的代謝產(chǎn)物變化，為藥源性腎毒性研究中闡明藥物的作用機制、實現(xiàn)藥物的安全性評價提供技術(shù)手段和平臺，為了解腎毒性的發(fā)生機制、指導(dǎo)臨床用藥提供參考。

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