骨唾液酸蛋白與維持性血液透析患者腹主動脈鈣化的關(guān)系

伍宏偉　張洋洋　余宗超　李珊珊　尹良紅　李　理　Berthold Hocher　劉璠娜

心血管疾病(CVD)是終末期腎病(ESRD)患者的主要并發(fā)癥之一，其風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高20～30倍[1]，占ESRD患者死亡率的50%。血管鈣化是慢性腎衰竭患者心血管事件發(fā)生的高危因素[2]。近來研究表明，血管鈣化是多因素參與的受高度調(diào)控的類成骨過程[3]。骨唾液酸蛋白(BSP)是最近發(fā)現(xiàn)的一種參與骨-血管軸代謝的蛋白，在尿毒癥患者鈣化的血管中膜內(nèi)表達(dá)，其影響血管鈣化過程機(jī)制不明確。本研究探討ESRD行維持性血液透析(MHD)患者血清BSP水平與腹主動脈鈣化的關(guān)系。

對象和方法

研究對象選取2016年5月至2017年2月就診于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液凈化中心規(guī)律維持性血液透析患者為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡>18歲且透析齡>3個(gè)月。排除接受過甲狀旁腺切除術(shù)，嚴(yán)重骨質(zhì)疏松，嚴(yán)重感染，惡性腫瘤，接受激素治療、嚴(yán)重的肝、肺疾病，妊娠、哺乳期婦女。136例患者參加篩選，符合入選條件者共75例。同時(shí)從健康體檢者中選取20名志愿者作為正常對照組。所有患者均接受德國費(fèi)森尤斯血液透析機(jī)進(jìn)行治療，使用碳酸氫鹽透析液，透析液鈣離子濃度為1.5 mmol/L。血管通路為自體動靜脈內(nèi)瘺或中心靜脈半永久導(dǎo)管。所有患者透析3次/周，4h/次，血流量為200～250 ml/min。所有入選患者均簽署知情同意書。本研究通過醫(yī)院倫理委員會的審核批準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)方法

一般情況收集患者的年齡、性別、身高、體重、透析齡、既往病史等一般資料。

實(shí)驗(yàn)室檢查所有患者均在血液透析前空腹采集血標(biāo)本。采用ABX MICROS 60檢測法進(jìn)行血常規(guī)分析。記錄紅細(xì)胞、血紅蛋白、血細(xì)胞比容等。采用TBA-120FR檢測血鈣、血磷、肌酐、尿素氮、白蛋白、總膽固醇、低度脂蛋白、高密度脂蛋白、C反應(yīng)蛋白等?；瘜W(xué)發(fā)光儀檢測全段甲狀旁腺素(iPTH)，25羥維生素D3。用廣州德為生物科技有限公司ELISA試劑檢測血清BSP。

影像學(xué)檢查按照KDIGO指南建議[4]，用側(cè)位腹部X線片檢測患者血管鈣化情況。由放射科醫(yī)師對患者進(jìn)行腹部側(cè)位X平片拍攝，包括11、12節(jié)胸椎骨，第1～5腰椎和第1、2節(jié)骶椎骨。根據(jù)Kauppila等[5]報(bào)道的半定量積分方法由2位不同的放射科醫(yī)師對患者第1節(jié)至第4節(jié)腰椎對應(yīng)的腹主動脈鈣化情況單獨(dú)進(jìn)行盲法評分，計(jì)算腹主動脈鈣化評分，最終得分取其平均值。評分方法如下：根據(jù)腹主動脈前壁和后壁鈣化斑塊的長度，分別給予0～3分：無鈣化者為0分；鈣化范圍小于1/3的動脈壁長度者為1分；鈣化范圍累及1/3～2/3動脈壁者為2分；鈣化范圍大于2/3的動脈壁長度者為3分。每個(gè)患者的腹主動脈鈣化總積分為0～24分不等。參考 CORD 研究中的分段方法[6]，根據(jù) AAC 得分將患者分為無或輕度鈣化組(AACs≤4)，中等鈣化組(5≤AACs≤15)和重度鈣化組(AACs≥16)。

結(jié)　　果

納入患者的一般情況共入選患者75例，其中男43例，女32例，平均(61.63±14.9)歲(26～91歲)。原發(fā)病為慢性腎小球腎炎 16例(22.2%)，糖尿病腎病23例(30.7%)，高血壓腎損害8例(10.7%)，多囊腎4例(5.3%)，腎結(jié)石5例(6.9%)，其他19例(25.3%)。

MHD患者腹主動脈鈣化情況75例MHD患者中，發(fā)生腹主動脈鈣化者56例(74.67%)，其中無鈣化者19例(25.33%)，輕度鈣化者19例(25.33%)，中度鈣化者27例(36%)，重度鈣化者10例(13.33%)。AAC中位數(shù)為4(0,24)。參考CORD[6]研究中的分段方法分為3組，組間不同臨床指標(biāo)比較結(jié)果見表1。

表1　不同腹主動脈鈣化積分組患者的臨床資料比較

HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；AACs：腹主動脈鈣化積分；iPTH:全段甲狀旁腺激素；BSP：骨唾液酸蛋白；a：與無或輕度鈣化組比較，P<0.05；b：與中度鈣化組比較，P<0.05

MHD患者血清BSP水平及其對AAC的影響20例健康對照組中平均年齡(58.43±12.11)歲，血清BSP中位數(shù)為14.38 (12.34,16.39)ng/ml。75例患者BSP中位數(shù)為20.12(18.63,24.21)ng/ml。MHD患者非鈣化組和鈣化組血清BSP中位數(shù)顯著高于健康對照組(圖1)。

圖1　MHD患者與健康對照組BSP值的比較MHD:維持性血液透析；BSP：血清骨唾液蛋白；+：與健康對照組比較，P<0.01；++：與MHD非鈣化組比較，P<0.05

BSP與iPTH的關(guān)系分析按BSP四分位數(shù)分為BSP≤18.64 ng/ml組、BSP 18.64～20.11 ng/ml組、BSP 20.12～24.20 ng/ml組、BSP≥24.21 ng/ml組，Mann-Whitney U檢驗(yàn)提示BSP≥24.21 ng/ml組iPTH水平高于BSP≤18.63 ng/ml組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)(圖2)。

圖2　不同四份位間距BSP組與iPTH差異的比較BSP:血清骨唾液蛋白；iPTH:全段甲狀旁腺激素；*：與BSP≤18.63 ng/ml組比較，P<0.05

AAC危險(xiǎn)因素分析采用單因素Logistic回歸分析AAC的危險(xiǎn)因素，其中年齡(OR=1.043,95% CI 1.008～1.080,P=0.016)、BSP(OR=1.248,95%CI 1.085～1.436,P=0.002)、iPTH(OR=1.003,95%CI 1.001～1.005,P=0.001)、尿素氮(OR=0.912,95% CI 0.834～0.997,P=0.043)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將單因素Logistic回歸分析有意義的變量進(jìn)行多因素Logistic回歸。以AACs≤4分作為臨界點(diǎn)分為兩組，采用二元多因素Logistic回歸分析AAC的危險(xiǎn)因素，校正透析齡、年齡、iPTH、尿素氮后發(fā)現(xiàn)，BSP是AAC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=1.175,95%CI 1.004～1.375,P<0.05)，見表2。

表2　腹主動脈鈣化影響因素的多因素 Logistic回歸分析

BSP:血清骨唾液蛋白；iPTH:全段甲狀旁腺激素

ROC曲線分析使用ROC曲線分析，BSP診斷MHD患者AAC的曲線下面積為0.718，95%CI 為0.604～0.833，P=0.001，提示血清BSP對診斷AAC的準(zhǔn)確度中等。其臨界值為21.51 ng/mL，靈敏度為0.711，特異度為0.595(圖3)。

圖3　血清骨唾液酸蛋白診斷腹主動脈鈣化的ROC曲線圖

討　　論

血管鈣化是慢性腎衰竭患者發(fā)生心血管事件的危險(xiǎn)因素之一。研究顯示CKD 3～5期患者，40%～60%存在動脈鈣化，CKD 5期患者的鈣化率高達(dá)80%～90%[7]。KDIGO指南建議使用側(cè)位腹部X線片檢測透析患者血管鈣化情況，結(jié)合kauppila半定量評分可有助于腹主動脈鈣化程度及進(jìn)展的評估[5,8]。本研究采用上述方法發(fā)現(xiàn)，75例 MHD患者中發(fā)生腹主動脈鈣化者56例(74.67%)，與Karohl等[7]研究結(jié)果基本相符。過去認(rèn)為，血管鈣化是體內(nèi)鈣、磷增高，導(dǎo)致礦物質(zhì)沉積引起的異位鈣化[9]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化與骨鈣化病理過程相似，是血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)介導(dǎo)的主動過程[10]。研究己證實(shí)[11]，在ESRD環(huán)境中，鈣化血管中成骨相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，骨細(xì)胞基質(zhì)鈣化相關(guān)蛋白如堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白表達(dá)上調(diào)，而作為VSMC特異標(biāo)志物的平滑肌肌動蛋白表達(dá)卻下調(diào)。BSP是一種骨代謝標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)在粥樣硬化血管中氧化低密度脂蛋白(oxLDL)增加了BSP表達(dá)，提示BSP參與血管鈣化[12]，

從BSP一級結(jié)構(gòu)分析可知，其靠近N-端的谷氨酸富集區(qū)具有結(jié)合羥磷灰石的作用，對羥磷灰石的最初晶核形成起著重要作用，引導(dǎo)礦化的形成，促進(jìn)鈣磷堆積，加速鈣化形成[13]，在組織鈣化中BSP是成骨細(xì)胞分化和發(fā)動礦化開始的標(biāo)志物，是反映礦化組織功能細(xì)胞狀態(tài)的良好標(biāo)志。在本研究中，并未發(fā)現(xiàn)血清BSP與血鈣、血磷有明顯的相關(guān)性，原因可能為BSP主要在礦化起始起作用，而本研究參與者為MHD患者，長期服用影響鈣磷水平的藥物，因此BSP與鈣、磷的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

研究發(fā)現(xiàn)，BSP在尿毒癥患者鈣化血管中膜內(nèi)表達(dá)，提示BSP表達(dá)可能是ESRD患者血管壁鈣化的早期表現(xiàn)[14]。一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，與CKD患者非鈣化組相比，CKD患者鈣化組BSP染色更顯著，此外，與非CKD患者鈣化組相比，CKD患者鈣化組BSP水平更高[15]。本研究發(fā)現(xiàn)MHD患者與年齡和性別匹配的健康對照組相比BSP值升高，此外MHD患者非鈣化組中BSP值較健康對照組BSP值高(P<0.01)，因此，不管MHD患者是否存在血管鈣化，BSP水平較正常人群升高，何種因素刺激MHD患者BSP表達(dá)，目前仍不清楚。此外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在MHD患者中，中、重度鈣化組BSP水平均高于無或輕度鈣化組(P<0.05)，而非鈣化組與輕度鈣化組BSP水平無差異。BSP參與血管鈣化的機(jī)制尚不明確。Farrokhi等[16]研究結(jié)果表明，在VSMC中oxLDL增加Runx2和BSP的表達(dá)，但是在通過siRNA抑制Runx2表達(dá)后，oxLDL不能影響B(tài)SP表達(dá)，提示BSP表達(dá)由Runx2轉(zhuǎn)錄因子控制。

90%以上尿毒癥患者存在繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)，iPTH是否可以直接或間接引起血管鈣化尚未有研究。本研究通過Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)iPTH是AAC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=1.003,95%CI 1.001～1.005,P<0.004)，與既往的研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)BSP≥24.21 ng/mL組iPTH水平高于BSP≤18.63 ng/mL組(P=0.011)。目前尚缺少BSP與iPTH關(guān)系的研究，Ogata等[17]指出，垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子-1(Pit-1)相關(guān)核心蛋白與BSP啟動子同源元件的競爭性結(jié)合抑制BSP的轉(zhuǎn)錄，iPTH通過阻斷這種競爭性結(jié)合，刺激BSP的轉(zhuǎn)錄，并且在不改變BSP mRNA穩(wěn)定性的同時(shí)增強(qiáng)mRNA的表達(dá)。因此，iPTH可能有刺激BSP表達(dá)的作用。

本研究中，MHD患者中、重度鈣化組的血清BSP水平均高于無或輕度鈣化組，多因素回歸分析提示血清BSP是AAC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)血清BSP對診斷MHD患者AAC的準(zhǔn)確度中等。但是，重度鈣化組的血清BSP水平與中度鈣化組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較少、BSP試劑盒測量差異有關(guān)。此外，研究未發(fā)現(xiàn)血磷、血鈣、堿性磷酸酶等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素[18]與血管鈣化的相關(guān)性，其主要原因?yàn)椴糠只颊呓?jīng)藥物治療后鈣、磷水平基本控制在正常范圍，另外還與血管鈣化的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)存在差異，樣本量較少有關(guān)，因此需要多中心大樣本的研究評價(jià)血管鈣化的危險(xiǎn)因素及BSP對AAC的診斷價(jià)值。

總之，血清BSP水平升高與MHD患者AAC相關(guān)，是發(fā)生AAC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。血清BSP濃度可能有助于MHD患者AAC程度的預(yù)測。 BSP介導(dǎo)血管鈣化的作用機(jī)制尚不清楚，仍需要大樣本前瞻性的研究進(jìn)一步探究BSP與CKD患者血管鈣化的關(guān)系。

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