微小RAN與肝相關(guān)疾病診療的關(guān)系

方安寧，嚴(yán)家來(lái)，周衛(wèi)鳳，黃玲，丁艷

（1.安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，安徽合肥230601；2.南京市第二醫(yī)院，江蘇南京210003）

1　miRNAs的產(chǎn)生及其在肝組織中的表達(dá)

成熟的miRNAs是一類長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，編碼miRNAs的基因在細(xì)胞核中經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ加工生成一種長(zhǎng)度約為70 nt的初始轉(zhuǎn)錄本pri-miRNAs。該轉(zhuǎn)錄本在RNA酶Dorsha的作用下加工成miRNA前體pre-miRNA。Exportin 5蛋白能與pre-miRNA特異性結(jié)合并將其輸出細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的pre-miRNA在Dicer酶的作用下進(jìn)一步被剪切成為一個(gè)不穩(wěn)定的dsRNA分子，接著在解旋酶的作用下生成成熟的單鏈miRNA，通過(guò)與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)（UTR）和編碼區(qū)域的堿基互補(bǔ)配對(duì)抑制靶mRNA翻譯，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因表達(dá)[2]。miRNAs的功能非常重要，包括參與早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝和細(xì)胞分化，目前認(rèn)為體內(nèi)至少30%的基因表達(dá)受miRNAs調(diào)控[3]。

既往對(duì)miRNAs的研究主要集中于它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的活動(dòng)，目前已有一些文獻(xiàn)報(bào)道了在肝癌中表達(dá)失調(diào)的miRNAs[4-15]，隨著miRNAs功能研究的不斷深入，miRNAs在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用也逐漸被研究者所關(guān)注。自2005年Murakami等首次報(bào)道m(xù)iRNAs在正常肝臟和肝癌中的表達(dá)差異以來(lái)，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了肝癌中異常表達(dá)的miRNAs[4-15]。在肝癌中表達(dá)上調(diào)的miRNAs有：miR-122、miR-21、miR-199a/b-3p、miR-223等，在正常肝臟中僅有9個(gè)miRNAs處于高豐度表達(dá)，占整個(gè)肝臟的miRNAs組的88.2%。其中表達(dá)最高的是miRNAs-122，第三高的miRNAs199a/b-3p的低表達(dá)與生存期顯著相關(guān)。在HCC中表達(dá)下調(diào)的miRNAs有Let-7a、miR-101、miR-122、miR-125a、miR-139a、miR-143、miR-195、miR-26和miR-29等。由HsuPW[16]預(yù)測(cè)人類miRNAs在病毒基因中作用位點(diǎn)的一個(gè)軟件（http：vita.mbe.nctu.edu.tw），Let-7a是HBV基因組的保守序列中的一個(gè)潛在的作用位點(diǎn)。另有文獻(xiàn)[17-18]報(bào)道組織中miR-17-5p在肝癌轉(zhuǎn)移中升高，可以作為預(yù)后標(biāo)志物。miRNAs在肝相關(guān)疾病組織中的研究比較熱門，但無(wú)法確定哪一個(gè)或哪幾個(gè)miRNA的表達(dá)失調(diào)在HCC發(fā)展中發(fā)揮核心作用，但是我們還是可以看出一些在肝癌診斷方面達(dá)成共識(shí)的miRNAs，像miR-122a、miR199[19]等，在肝癌中不同miRNAs的表達(dá)所影響的信號(hào)通路（見(jiàn)圖1）[4]可以很直觀地發(fā)現(xiàn)受體絡(luò)氨酸激酶（這里表示肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF/蛋氨酸原癌基因MET唯一軸），RAS和P13K途徑被下調(diào)的miR-199a/b-3p，Let-7和上調(diào)的miR-21所影響，導(dǎo)致細(xì)胞的癌變。miR-199a/b-3p、Let-7、miR-21這3種miRNA在病毒肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞性癌患者的外周循環(huán)中也比較有意義，是否可以作為腫瘤標(biāo)志物尚不可知。在HCC腫瘤發(fā)生過(guò)程中各種miRNAs所起的作用，其中miR-21、miR-199、miR-221、miR-122、miR-101和Let-7同樣起重要作用，見(jiàn)圖2[12]。

圖1　肝癌中不同miRNAs的表達(dá)的信號(hào)通路示意圖

圖2　miR－21、miR－199、miR－221、miR－122、miR－101和Let－7在HCC發(fā)生中的作用

2　血清循環(huán)miRNA與疾病的診斷

半個(gè)多世紀(jì)前，Mandel和Metais在血漿和血清中發(fā)現(xiàn)了循環(huán)核酸（CNAs）[20]。隨著不斷改進(jìn)檢測(cè)技術(shù)和方法，循環(huán)核酸在臨床疾病診斷中的應(yīng)用得到了較大進(jìn)步，在很多領(lǐng)域取得了巨大成就，如器官移植、遺傳性疾病的產(chǎn)前檢查等[21]。早期的研究也表明，在腫瘤患者的血漿中，RNA的量顯著增加，腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)譜也和正常細(xì)胞有顯著差異[22-23]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的miRNA也和腫瘤等各種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。由于病變組織細(xì)胞中的miRNA表達(dá)往往失調(diào)，且miRNA在血漿中極其穩(wěn)定，研究者推測(cè)miRNA可以作為一種理想的以血液檢測(cè)為基礎(chǔ)的生物標(biāo)志。

Chen等[24]通過(guò)對(duì)健康中國(guó)人的血清進(jìn)行Solexa測(cè)序，鑒定了男性和女性血清中的miRNA數(shù)目分別為100和91。Taylor等[25]對(duì)同一卵巢癌患者的細(xì)胞和外核體研究發(fā)現(xiàn)，在467條miRNA中有218條呈現(xiàn)陽(yáng)性。Mitchell等[26]通過(guò)分離健康人血漿中的18～24個(gè)核苷酸的RNA，得到37種左右miRNAs，包括Let-7a、miR-16、miR-15b等。對(duì)3份獨(dú)立的健康人血漿miR-16、miR-24（血漿中中等豐度表達(dá)）和miR-15b（血漿中低等豐度表達(dá)）進(jìn)行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)這3種miRNAs的濃度為8 910～133 970拷貝/微升。同時(shí)，他們將人的前列腺癌細(xì)胞22Rvl導(dǎo)入NOD/SCID免疫缺陷小鼠中，發(fā)現(xiàn)能在小鼠血漿中檢測(cè)到原本不存在的miR-629*和miR-660，而且miRNAs的豐度與腫瘤的大小相關(guān)，并可作為診斷腫瘤的生物標(biāo)志物。

3　循環(huán)中miRNAs與肝相關(guān)疾病診療的關(guān)系

循環(huán)中miRNAs可作為疾病的“指紋”去預(yù)測(cè)生存狀態(tài)[27-30]。大多數(shù)人認(rèn)為循環(huán)RNA來(lái)自細(xì)胞凋亡或壞死、細(xì)胞主動(dòng)釋放以及循環(huán)細(xì)胞的分裂。有些核酸蛋白1（NPM1）能夠介導(dǎo)部分miRNAs由胞內(nèi)釋放到胞外并且保護(hù)它在胞外不被核酸酶降解，有些循環(huán)miRNA由多種未知的成分構(gòu)成。由于它們含量豐富且具有組織的特異性、循環(huán)中的相對(duì)穩(wěn)定性，循環(huán)中miRNAs作為獨(dú)特的、易獲得的分子標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)和監(jiān)控癌癥具有深遠(yuǎn)的影響。循環(huán)中的miRNAs能夠反映組織的一些信號(hào)，像丙型肝炎患者血清miR-122表達(dá)比正常人高，且和ALT表達(dá)有非常高的一致性[31]，而且還與病毒載量、乙肝表面抗原量、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）等相關(guān)[32]。有學(xué)者報(bào)道m(xù)iR-500在外周血中的表達(dá)隨肝癌術(shù)前術(shù)后發(fā)生變化，但只觀察了3例[33]。最新研究表明，miR-101可能是HBV相關(guān)肝癌診斷及進(jìn)展監(jiān)控的潛在標(biāo)志物[34-35]。

循環(huán)miRNAs在肝癌中表達(dá)失調(diào)的報(bào)道比較少[36]，具體哪些miRNA在診斷中起主要作用目前還存在很多爭(zhēng)論，距離在臨床診斷中應(yīng)用還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本課題擬進(jìn)行如下3個(gè)方面工作：（1）以乙型及丙型肝炎單獨(dú)和重疊感染、肝硬化和肝細(xì)胞癌患者血清為參考樣本，通過(guò)exqion的LNATMmiRNA芯片對(duì)健康對(duì)照、肝硬化及肝癌患者血清中潛在的循環(huán)miRNAs進(jìn)行初步分析與對(duì)比，篩選可能與肝病相關(guān)的miRNAs；（2）通過(guò)臨床病例對(duì)照研究，用莖環(huán)法實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)幾種可能與肝病相關(guān)的循環(huán)miRNAs進(jìn)行初步驗(yàn)證，以此初步探索循環(huán)miRNAs作為肝臟相關(guān)疾病分子標(biāo)志物的可能性，再聯(lián)合AFP、AFP-L3及GP73做相關(guān)性研究及通過(guò)受試者工作特征曲線（ROC曲線）來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的特異性和準(zhǔn)確性；（3）利用生物信息學(xué)并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)優(yōu)勢(shì)的miRNAs潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并探討肝病患者血清中的miRNAs可能原因。期待能發(fā)現(xiàn)特異性較強(qiáng)的miRNAs生物標(biāo)志物，為早期診斷或鑒別診斷肝癌及為肝相關(guān)疾病的miRNAs靶向治療提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bartel D P．MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J]．Cell，2004（2）：281－297．

[2]Kim V N，Nam J W．Genomics of microRNA[J]．TRENDS in Genetics，2006，22（3）：165－173．

[3]Bushati N，Cohen S M．microRNA functions[J]．Cell Dev Biol，2007（23）：175－205．

[4]Gramantieri L，F(xiàn)ornari F，Callegari E，et al．MicroRNA involvement in hepatocellular carcinoma[J]．Journal of cellular and molecular medicine，2008，12（6a）：2189－2204．

[5]Yang H，Kong W，He L，et al．MicroRNA expression profiling in human ovarian cancer：miR－214 induces cell survival and cisplatin resistance by targeting PTEN[J]．Cancer Research，2008，68（2）：425－433．

[6]Huang Y S，Dai Y，Yu X F，et al．Microarray analysis of microRNA expression in hepatocellular carcinoma and non－tumorous tissues without viral hepatitis[J]．Journal of gastroenterology and hepatology，2008，23（1）：87－94．

[7]Ladeiro Y，Couchy G，Balabaud C，et al．MicroRNA profiling in hepatocellular tumors is associated with clinical features and oncogene/tumor suppressor gene mutations[J]．Hepatology，2008，47（6）：1955－1963．

[8]Varnholt H，Drebber U，Schulze F，et al．MicroRNA gene expression profile of hepatitis C virus－associated hepatocellular carcinoma[J]．Hepatology，2008，47（4）：1223－1232．

[9]Wang Y，Lee A T C，Ma J Z I，et al．Profiling microRNA expression in hepatocellular carcinoma reveals microRNA－224 up－regulation and apoptosis inhibitor－5 as a microRNA－22－specific target[J]．Journal of Biological Chemistry，2008，283（19）：13205－13215．

[10]Wong Q W，Lung R W，Law P T，et al．MicroRNA－223 is commonly repressed in hepatocellular carcinoma and potentiates expression of Stathmin1[J]．Gastroenterology，2008，135（1）：257－269．

[11]Anadol E，Schierwagen R，Elfimova N，et al．Circulating microRNAs as a marker for liver injury in human immunodeficiency virus patients[J]．Hepatology，2015，61（1）：46－55．

[12]Mizuguchi Y，Takizawa T，Yoshida H，et al．Dysregulated microRNAs in progression of hepatocellular carcinoma：A systematic review[J]．Hepatol Res，2015，46（5）：391－406．

[13]Budhu A，Jia H L，F(xiàn)orgues M，et al．Identification ofmetastasis-related microRNAs in hepatocellular carcinoma[J]．Hepatology，2008，47（3）：897－907．

[14]Gramantieri L，F(xiàn)erracin M，F(xiàn)ornari F，et al．Cyclin G1 is a target of miR－122a，a microRNA frequently down－regulated in human hepatocellular carcinoma[J]．Cancer research，2007，67（13）：6092－6099．

[15]Ura S，Honda M，Yamashita T，et al．Differential microRNA expression between hepatitis B and hepatitis C leading disease progression to hepatocellular carcinoma[J]．Hepatology，2009，49（4）：1098－1112．

[16]Lewis B P，Shih I，Jones－Rhoades M W，et al．Prediction of mammalian microRNA targets[J]．Cell，2003，115（7）：787－798．

[17]Chen L，Jiang M，Yuan W，et al．miR－17－5p as a novel prognostic marker for hepatocellular carcinoma[J]．Journal of Investigative Surgery，2012，25（3）：156－161．

[18]Zheng J，Dong P，Gao S，et al．High expression of serum miR－17－5p associated with poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma[J]．Hepato－gastroenterology，2012，60（123）：549－552．

[19]Wang C，Song B，Song W，et al．Underexpressed microRNA－199b－5p targets Hypoxia－Inducible Factor－1α in hepatocellular carcinoma and predicts prognosis of hepatocellular carcinoma patients[J]．Journal of gastroenterology and hepatology，2011，26（11）：1630－1637．

[20]Mandel P M．Les acides nucleiques du plasma sanguin chez 1'Homme[J]．C RAcad Sci Paris，1948（142）：241－243．

[21]Tsang J C．Circulating nucleic acids in plasma serum[J]．Pathology，2007，39（2）：197－207．

[22]Chan K C．Circulating tumour－derived nucleic acids in cancer patients：potential applications as tumour markers[J]．Br J Cancer，2007，96（5）：681－685．

[23]Anker P，Mulcahy H，Stroun M．Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer：time for large－scale clinical studies？[J]．Int J Cancer，2003，103（2）：49－152．

[24]Chen X，Y Ba，L Ma，et al．Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J]．Cell Res，2008，18（10）：997－1006．

[25]Taylor D D，C Gercel－Taylor．MicroRNA signatures of tumor－derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer[J]．Gynecol Oncol，2008，110（1）：13－21．

[26]Mitchell P S，Parkin R K，Kroh E M，et al．Circulating microRNAs as stable blood－based markers for cancer detection[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105（30）：10513－10518．

[27]Xu J，Wu C，Che X，et al．Circulating MicroRNAs，miR－21，miR－122 and miR－223，in patients with hepatocellular carcinoma or chronic hepatitis[J]．Molecular carcinogenesis，2011，50（2）：136－142．

[28]Qi P，Cheng S，Wang H，et al．Serum microRNAs as biomarkers for hepatocellular carcinoma in Chinese patients with chronic hepatitis B virus infection[J]．PloS one，2011，6（12）：28486．

[29]Qu K Z，Zhang K，Li H R，et al．Circulating microRNAs as biomarkers for hepatocellular carcinoma[J]．Journal of clinical gastroenterology，2011，45（4）：355－360．

[30]Diaz G，Melis M，Tice A，et al．Identification of microRNAs specifically expressed in hepatitis C virus－associated hepatocellular carcinoma[J]．International Journal of Cancer，2013，133（4）：816－824．

[31]Bihrer V，F(xiàn)riedrich－Rust M，Kronenberger B，et al．Serum miR－122 as a biomarker of necroinflammation in patients with chronic hepatitis C virus infection[J]．The American journal of gastroenterology，2011，106（9）：1663－1669．

[32]Akamatsu S，Hayes CN，Tsuge M，et al．Differences in serum microRNA profiles in hepatitis B and C virus infection[J]．J Infect，2015，70（3）：273－287．

[33]Yamamoto Y，Kosaka N，Tanaka M，et al．MicroRNA－500 as a potential diagnostic marker for hepatocellular carcinoma[J]．Biomarkers，2009，14（7）：529－538．

[34]Xie Y，Yao Q，Butt AM，et al．Expression profiling of serum microRNA－101 in HBV－associated chronic hepatitis，liver cirrhosis，and hepatocellular carcinoma[J]．Cancer Biol Ther，2014，15（9）：1248－1255．

[35]Sheng Y，Li J，Zou C，et al．Downregulation of miR－101－3p by hepatitis B virus promotes proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells by targeting Rab5a[J]．Arch Virol，2014，159（9）：2397－2410．

[36]Li L M，Hu Z B，Zhou Z X，et al．Serum microRNA profiles serve as novel biomarkers for HBV infection and diagnosis of HBV－positive hepatocarcinoma[J]．Cancer research，2010，70（23）：9798－9807．■