電針對(duì)面神經(jīng)損傷兔面神經(jīng)核中GDNF、CHAT表達(dá)的影響

童　威，何劍波，張文岐，晁　旭，陳謙謙

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712000；2. 陜西省西安市西電集團(tuán)醫(yī)院，陜西 西安 710000；3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

面神經(jīng)損傷在臨床中較常見(jiàn)，目前多認(rèn)為與自主神經(jīng)功能不穩(wěn)、局部血液循環(huán)障礙、病毒感染等有關(guān)，多予以抗病毒、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等治療，嚴(yán)重者行外科手術(shù)，但部分患者效果不理想。近年研究顯示，針灸治療周圍神經(jīng)損傷有一定優(yōu)勢(shì)[1]，其中電針對(duì)面神經(jīng)損傷療效顯著，能促進(jìn)面神經(jīng)損傷修復(fù)，使組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)增強(qiáng)[2-3]，但電針治療促進(jìn)面神經(jīng)損傷修復(fù)的機(jī)制尚不清楚。本研究利用兔面神經(jīng)損傷模型，觀察了電針對(duì)面神經(jīng)核中膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT)表達(dá)及神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響，旨在探討電針對(duì)面神經(jīng)損傷再生修復(fù)的作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭健康家兔[西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 合格證號(hào)：SCXK(陜)2014-003]76只，雌雄各半，6～8月齡，體質(zhì)量(2.5±0.25)kg，單籠普通顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2分組及造模將健康家兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組、西藥組，其中假手術(shù)組4只，余每組24只。除假手術(shù)組外，其余組均參照牙祖蒙[4]、姜國(guó)華等[5]動(dòng)物模型制備方法制備面神經(jīng)損傷模型：采用3%戊巴比妥鈉1 mL/kg靜脈麻醉家兔，左側(cè)面部手術(shù)部位用脫毛劑脫毛、消毒，鋪無(wú)菌孔巾，取耳屏前至下頜角下緣“S”形切口，鈍性剝離皮膚、皮下組織，在腮腺筋膜表面向前剝開(kāi)皮瓣，暴露面神經(jīng)頰支，在距莖乳孔0.5 cm處(定位)用小號(hào)持針器鉗夾面神經(jīng)，滿扣(壓力約5 kg定量)時(shí)間為5 s(定時(shí))，損傷面寬約1.5 mm，最后分層縫合肌肉、皮膚，飼養(yǎng)。假手術(shù)組麻醉后切開(kāi)皮膚及鈍性剝離面神經(jīng)，不做鉗夾，相同方法縫合。

1.3干預(yù)處理假手術(shù)組、模型組術(shù)后不給予干預(yù)；西藥組造模后第1天開(kāi)始給予維生素B110 mg、維生素B1250 μg加地塞米松2 mg肌肉注射，1次/d，地塞米松每7 d減半，連續(xù)4周；電針組造模后第1天開(kāi)始進(jìn)行電針治療，每天連續(xù)治療30 min，治療5 d后休息2 d，療程4周。電針腧穴定位參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸分會(huì)制定的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》、中國(guó)獸牧醫(yī)學(xué)會(huì)編寫(xiě)的《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》及《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》。翳風(fēng)：乳突尖至下頜升支后緣垂線之中點(diǎn)，直刺1.0 cm；顴髎：外眥垂線和顴骨顳突下緣凹陷處，直刺垂直進(jìn)針約2.0 cm；地倉(cāng)：口角外側(cè)1.0 cm，直刺0.5 cm；頰車：下頜角前上方咬肌最豐隆處中點(diǎn)，直刺0.5 cm；陽(yáng)白：眶上緣中點(diǎn)上方約0.5 cm處，平刺進(jìn)針約 1.5 cm；四白：眶下緣中點(diǎn)向下 0.5 cm 處，斜刺45°角進(jìn)針約 2.0 cm；合谷：掌背側(cè)第一、第二掌骨間，約第二掌骨中點(diǎn)橈側(cè)，直刺0.2 cm。頰車與地倉(cāng)連接；翳風(fēng)與顴繆連接；陽(yáng)白與四白連接；合谷：埋針，不予以電刺激。采用疏密波進(jìn)行刺激，頻率為18～20 Hz，電壓1.5 V。

1.4樣本采集分別于術(shù)后1，2，3，4周，每組隨機(jī)取6只兔(假手術(shù)組每次1只)，用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉后,自領(lǐng)下至小腹行胸、腹聯(lián)合切口，切斷肋骨，剪斷膈肌，暴露心臟。穿刺針頭刺入左心室，用軟靜脈留置導(dǎo)管沿左心室經(jīng)主動(dòng)脈瓣插入主動(dòng)脈，剪開(kāi)左心耳，先用冰生理鹽水250 mL快速?zèng)_洗組織內(nèi)血液，待流出的液體清亮后，用4%多聚甲醛固定液快速推注約400 mL，取左側(cè)腦干組織(面神經(jīng)核位于腦橋下部靠近腹側(cè))。將所取標(biāo)本迅速放入含有1∶1 000 DEPC的4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS固定液中固定，室溫下經(jīng)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，以備切片。

1.5面神經(jīng)核中神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)觀察與GDNF、CHAT檢測(cè)切片HE染色后進(jìn)行鏡下觀察。免疫組織化學(xué)法進(jìn)行GDNF、CHAT檢測(cè)，試劑盒均購(gòu)自武漢博奧森公司,按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，以細(xì)胞漿內(nèi)或核膜上出現(xiàn)棕黃色顆?；虬咂瑸殛?yáng)性細(xì)胞，每兔取相同部位的切片，在10×40倍光鏡下每張片取5個(gè)視野，在光鏡下計(jì)數(shù)面神經(jīng)核中GDNF、CHAT陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

2　結(jié)　　果

2.1各組面神經(jīng)核中神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)HE染色后，假手術(shù)組面神經(jīng)核神經(jīng)元胞體中細(xì)胞輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整。模型組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核濃縮、變形，部分細(xì)胞甚至出現(xiàn)核仁消失、變性壞死，可見(jiàn)點(diǎn)狀或片狀染色增加或減少, 出現(xiàn)圓形空泡，細(xì)胞輪廓模糊或消失。與模型組比較，電針組、西藥組神經(jīng)細(xì)胞輪廓結(jié)構(gòu)清晰完整，腫脹、空泡數(shù)目減少，細(xì)胞數(shù)目增多。見(jiàn)圖1～4。

圖1　術(shù)后4周假手術(shù)組兔面神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)(HE，×400)

圖2　術(shù)后4周電針組兔面神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)(HE，×400)

2.2各組兔面神經(jīng)核中GDNF表達(dá)情況術(shù)后1周，4組間面神經(jīng)核中GDNF表達(dá)情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；術(shù)后2，3，4周，模型組GDNF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，且呈先下降后上升的趨勢(shì)，術(shù)后3周陽(yáng)性表達(dá)數(shù)最少，術(shù)后4周陽(yáng)性表達(dá)數(shù)回升；電針組、西藥組GDNF陽(yáng)性表達(dá)數(shù)均明顯高于模型組(P均<0.05)，且電針組明顯高于西藥組(P均<0.05)。見(jiàn)表1及圖5～8。

圖3　術(shù)后4周模型組兔面神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)(HE，×400)

圖4　術(shù)后4周西藥組兔面神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)(HE，×400)

表1　各組兔面神經(jīng)核中GDNF表達(dá)情況個(gè))

注：①與模型組比較，P<0.05；②與西藥組比較，P<0.05。

圖5　術(shù)后4周假手術(shù)組兔面神經(jīng)核中GDNF表達(dá)情況(免疫組化，×400)

2.3各組兔面神經(jīng)核中CHAT表達(dá)情況術(shù)后1，2,3,4周，模型組CHAT陽(yáng)性表達(dá)數(shù)均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，且呈先下降后上升的趨勢(shì)，

圖6　術(shù)后4周電針組兔面神經(jīng)核中GDNF表達(dá)情況(免疫組化，×400)

圖7　術(shù)后4周模型組兔面神經(jīng)核中GDNF表達(dá)情況(免疫組化，×400)

圖8　術(shù)后4周西藥組兔面神經(jīng)核中GDNF表達(dá)情況(免疫組化，×400)

術(shù)后2周陽(yáng)性表達(dá)數(shù)最少；電針組、西藥組CHAT陽(yáng)性表達(dá)數(shù)隨時(shí)間增加而增高，相鄰兩治療階段比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。電針組各時(shí)間段CHAT陽(yáng)性表達(dá)數(shù)均明顯高于模型組和西藥組(P均<0.05)；術(shù)后1周，西藥組CHAT陽(yáng)性表達(dá)數(shù)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但術(shù)后2，3，4周均明顯高于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表2及圖9～12。

表2　各組兔面神經(jīng)核中CHAT表達(dá)情況個(gè))

注：①與模型組比較，P<0.05；②與西藥組比較，P<0.05。

圖9　術(shù)后4周假手術(shù)組兔面神經(jīng)核CHAT表達(dá)情況(免疫組化，×400)

圖10　術(shù)后4周電針組兔面神經(jīng)核CHAT表達(dá)情況(免疫組化，×400)

圖11　術(shù)后4周模型組兔面神經(jīng)核CHAT表達(dá)情況(免疫組化，×400)

圖12　術(shù)后4周西藥組兔面神經(jīng)核CHAT表達(dá)情況(免疫組化，×400)

3　討　　論

中醫(yī)對(duì)周圍性面神經(jīng)損傷的治療有豐富的經(jīng)驗(yàn)，其中針灸質(zhì)量可促進(jìn)氣血循環(huán)，改善代謝，改善肢體痿軟[6]。劉志丹等[7]綜合大量的實(shí)踐研究文獻(xiàn)認(rèn)為選用經(jīng)穴治療面神經(jīng)損傷具有較好的療效；劉佰成等[8]觀察表明，運(yùn)用針灸綜合治療周圍性面癱療效明顯優(yōu)于單純中藥治療；姜喜鳳等[9]報(bào)道，運(yùn)用普通針刺結(jié)合電針治療周圍性面癱的效果明顯優(yōu)于單純使用透針治療；蔣小旭[10]運(yùn)用電針治療面神經(jīng)炎取得良好效果。上述研究表明針灸治療面神經(jīng)損傷具有較好的療效。本實(shí)驗(yàn)在現(xiàn)代科技的基礎(chǔ)上，采用電針疏密波刺激地倉(cāng)、頰車等具有通經(jīng)活絡(luò)、溫經(jīng)散寒作用的穴位，進(jìn)一步觀察了電針對(duì)面神經(jīng)損傷的修復(fù)作用，結(jié)果顯示，電針組神經(jīng)細(xì)胞輪廓結(jié)構(gòu)清晰完整，腫脹、空泡數(shù)目減少，細(xì)胞數(shù)目增多，證實(shí)電針治療可修復(fù)面神經(jīng)損傷。

GDNF可以保護(hù)多巴胺(DA)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，促進(jìn)中樞運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、外周運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺(jué)神經(jīng)元、交感神經(jīng)元等的存活和生長(zhǎng)發(fā)育,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育、損傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，與帕金森病、腦缺血、神經(jīng)性疼痛及癲癇等疾病密切相關(guān)[11]。 GDNF對(duì)面神經(jīng)損傷的修復(fù)作用機(jī)制主要是通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，GDNF受體系統(tǒng)主要是GDNF家族受體α(GFRα)和Ret蛋白組成的復(fù)合受體系統(tǒng)，一部分通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(GPI)結(jié)合位點(diǎn)錨定于細(xì)胞膜外表面的GFRα，另一部分通過(guò)跨膜的酪氨酸激酶Ret蛋白，信號(hào)得以傳遞?？缒さ腞et蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化[12]。GDNF與細(xì)胞表面的GFRα 結(jié)合形成GDNF-GFRα復(fù)合體后激活Ret受體，使細(xì)胞內(nèi)Ret-Shc-Grb2蛋白復(fù)合體形成，而后Ret-Shc-Grb2蛋白復(fù)合體激活相關(guān)蛋白，從而引起一系列信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮其生物學(xué)作用，促進(jìn)神經(jīng)元的損傷修復(fù)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后2，3，4周，模型組GDNF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均明顯低于假手術(shù)組，且呈先下降后上升的趨勢(shì)；電針組、西藥組GDNF陽(yáng)性表達(dá)數(shù)均明顯高于模型組，且電針組明顯高于西藥組。提示電針刺激后，面神經(jīng)核內(nèi)GDNF表達(dá)升高，從而引起GDNF與其受體結(jié)合增加，兩者結(jié)合可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育、損傷修復(fù)等。

CHAT是一種在神經(jīng)元胞體內(nèi)合成的酶，當(dāng)該轉(zhuǎn)移酶被合成以后，通過(guò)軸質(zhì)流動(dòng)方式轉(zhuǎn)移到神經(jīng)軸突末端，其功能是將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到膽堿上，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的形成。膽堿能系統(tǒng)參與多種神經(jīng)功能的作用，一些膽堿能神經(jīng)元的改變能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，故CHAT通常被用來(lái)標(biāo)記神經(jīng)元功能狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后1，2,3,4周模型組CHAT陽(yáng)性表達(dá)數(shù)均明顯低于假手術(shù)組，且呈先下降后上升的趨勢(shì)；電針組、西藥組CHAT陽(yáng)性表達(dá)數(shù)隨時(shí)間增加而增高，且電針組各時(shí)間段CHAT陽(yáng)性表達(dá)數(shù)均明顯高于模型組和西藥組。提示電針刺激可增加CHAT的表達(dá)，CHAT的增多有利于乙酰膽堿的形成，進(jìn)一步促進(jìn)膽堿能系統(tǒng)參與多種神經(jīng)功能，有利于損傷面神經(jīng)的再生修復(fù)。

綜上所述，電針刺激可促進(jìn)面神經(jīng)損傷修復(fù)，其機(jī)制可能與增加面神經(jīng)核中GDNF、CHAT的表達(dá)有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]陳磊. 中醫(yī)藥治療周圍神經(jīng)損傷的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2016,25(2):29-30

[2]章明星,劉陽(yáng)陽(yáng)，劉建衛(wèi)，等. 電針治療周圍神經(jīng)損傷的機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)雜志,2016,43(8):1769-1771

[3]牙祖蒙,王建華，李忠禹，等. 家兔面神經(jīng)損傷后穴位針刺對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2000,6(4):234-236

[4]牙祖蒙. 穴位針刺對(duì)面神經(jīng)再生影響的動(dòng)物模型制作[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理,1999,16(1):15-17

[5]姜國(guó)華,衛(wèi)彥，單麗莉，等. 穴位電刺激對(duì)周圍性面神經(jīng)損傷兔面神經(jīng)核中BDNF的影響[J]. 針灸臨床雜志,2006,22(1):44-46

[6]李玲. 中醫(yī)治療周圍神經(jīng)損傷探討[J]. 中醫(yī)研究,2014,27(8):10-11

[7]劉志丹,宋宣慧，唐藝丹，等. 對(duì)影響針灸治療面癱療效若干環(huán)節(jié)問(wèn)題的分析[J]. 針灸臨床雜志,2016,32(2):88-93

[8]劉佰成,周基松. 針灸綜合治療周圍性面癱的療效分析[J]. 大家健康,2016,10(11):107-108

[9]姜喜鳳,王健，王軍. 探討針刺結(jié)合電針治療周圍性面癱恢復(fù)期臨床效果[J]. 中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理,2016,7(8):141-142

[10] 蔣小旭. 電針治療面神經(jīng)炎60例[J]. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,17(2):25-26

[11] 吳娜,董瑞國(guó). 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子研究進(jìn)展[J]. 徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,30(7):487-489

[12] Forrest SL,Keast JR. Expression of receptors for glial cell line-derived neurotrophic factor family ligands in sacral spinal cord reveals separate targets of pelvic afferent fibers [J]. J Comp Neurol，2008,506(6):989-1002

[13] Paratcha G,Ledda F. GDNF and GFRalpha:a versatile molecular complex for developing neurons [J]. Trends Neurosci,2008,31(8):384-391