云南省部分地區(qū)規(guī)模豬場豬偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查

蘇琳琳，朱　麗，錢祁昇，趙翔玥，呂念詞，鄭曉琳，張?zhí)煊穑瘛】?，張以?/p>

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物健康檢測與評價云中心，云南昆明　650201）

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起豬的一種急性高死亡率傳染病[1]，傳播速度快，致病性強，危害嚴重。PRV屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科[2]。PR屬于自然疫原性疾病，被我國列為二類動物疫病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報動物疫病[3]。豬是該病的自然宿主[4]，包括野豬[5-9]。PRV可以通過多種途徑在豬群中傳播，包括消化道、呼吸道、生殖道，也可以機械傳播[10]。為了解云南省豬場中的PR流行情況，從而為預(yù)防和控制該病提供數(shù)據(jù)支持，在云南省部分大中小型豬場隨機采樣，對采集的血清進行 ELISA檢測，對采集的可疑病料進行PCR檢測。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1樣品 從昆明、曲靖、玉溪、楚雄、大理、宣威、西雙版納等9個地區(qū)的54個規(guī)?；i場，隨機采集6 555份全血和381份疑似病料（母豬52份、保育豬94 份、公豬精液20份、育肥豬103份、流產(chǎn)胎兒和仔豬112 份）。

1.1.2試驗材料 豬偽狂犬病 gE-ELISA、gBELISA 診斷試劑盒（美國 IDEXX 公司）；Mini BEST viral RNA/DNA extraction kit ver 5.0（Takara大連寶生物公司）；2×Easy SuperMix（大連寶生物公司）；膠回收試劑盒（全式金）；ddH2O（大連寶生物公司）。

1.2　方法

1.2.1血清學(xué)檢測 將采集的6 555份全血處理后，取其血清，根據(jù)豬偽狂犬病gE-ELISA診斷試劑盒使用說明進行抗體檢測。在陰、陽性對照成立的前提下，如果待檢樣品的S/N值≤0.60，判定為PRV gB（gE）抗體陽性；如果待檢樣品S/N值＞0.7，判定為PRV gB（gE）抗體陰性。

1.2.2病原學(xué)檢測 將凍存的組織樣品（主要是脾臟、淋巴結(jié)，少量為腦組織）取出，置室溫解凍；在超凈工作臺中，用滅菌剪刀、鑷子剪至米粒大小，然后轉(zhuǎn)移至預(yù)先滅菌處理好的研缽中，加入液氮研磨；最后分裝到2 mL滅菌離心管中，-70 ℃凍存待檢。

1.2.3引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中的PRV核苷酸序列，應(yīng)用DNAStar軟件設(shè)計1對引物（PRV-F、PRV-R）。引物由（華大基因）合成。引物信息見表1。

表1　PRV引物

1.2.4樣品DNA提取 根據(jù) Mini BEST viral RNA/DNA extraction kit ver 5.0 試劑盒使用說明進行樣品DNA提取。

1.2.5PCR擴增 取1 μL所提DNA作為模板，加入12.5 μL 2X Easy Taq SuperMix、9.5 μL dd H2O、1 μL PRV-F、1 μL PRV-R。反應(yīng)體系為：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，34個循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min。

1.2.6PCR產(chǎn)物純化測序 對PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)試劑盒說明書做膠回收目的條帶，然后克隆轉(zhuǎn)化；將回收產(chǎn)物將送至華大基因進行測序鑒定。

2　結(jié)果

2.1　血清學(xué)檢測

2.1.1不同年份 2016—2017年在云南省不同地區(qū)采集的6 555份血清樣品中，PRV gB抗體陽性率為88.7%，gE抗體陽性率（野毒感染率）為13.5%（表2）。

表 2　不同年份PRV抗體檢測結(jié)果

2.1.2不同地區(qū) 檢測結(jié)果顯示：楚雄市的gB抗體陽性率最低，為78.5%，但gE抗體陽性率（野毒感染率）最高，為21.8%；大理市g(shù)B抗體陽性率最高，為95.1%，但野毒感染率最低，為6.0%（表3）。

表3　不同地區(qū)PRV抗體檢測結(jié)果

2.1.3不同季度 檢測結(jié)果顯示，第2季度的野毒感染率最高，為20.3%，第1季度最低，為8.7%。不同季度的PRV抗體檢測結(jié)果見表4。

表 4　不同季度PRV抗體檢測結(jié)果

2.2　病原學(xué)檢測

2.2.1不同年份 對不同年份送檢的疑似PR病料進行 PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)2016、2017年的病原檢出率分別為 22.1%、23.7%，表明云南省的PRV野毒感染較嚴重（表5）。對送檢病料的PCR檢測鑒定結(jié)果見圖1。

表5　不同年份送檢病料PCR檢測結(jié)果

圖1　部分病料的PCR擴增結(jié)果

2.2.2不同地區(qū) 對2016—2017年云南省不同地區(qū)送檢的疑似病料進行PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)玉溪市病原檢出率最高（52.6%），德宏市最低（16.4%）。具體檢測結(jié)果見表6。

表6　不同地區(qū)送檢病料PCR檢測結(jié)果

2.2.3不同季度 對不同季度送檢的疑似PRV 感染病料進行 PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)各季度的病原檢出率較為均衡，在20%～30%之間。具體結(jié)果見表7。

2.2.4不同豬群 對云南省不同地區(qū)送檢的不同生產(chǎn)階段豬群病料進行 PCR檢測。檢測結(jié)果顯示，母豬的病原檢出率最高（28.8%），而育肥豬最低（20.4%）。具體結(jié)果見表8。

表7　不同季度送檢病料PCR檢測結(jié)果

表8　不同生產(chǎn)階段豬群病料 PCR 檢測結(jié)果

3　分析與討論

目前，我國應(yīng)用 PRV gE基因缺失活疫苗來控制該病。因此，豬血清中檢出gE抗體可確診為野毒感染[11]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2016、2017年的PRV gE抗體陽性率分別為13.2%、13.8%，疑似樣品的病原檢出率分別為22.1%、23.7%。該結(jié)果與楊珊珊[12]等報道的2016年江蘇省部分地區(qū)PR樣本陽性率（43.2%），以及畢俊龍[13]等報道的2009—2013 年云南省楚雄地區(qū)規(guī)模場PR樣本陽性率（37.67%）相比偏低，而接近于鄒敏等[14]報道的2012—2013 年全國18 個省份393 個豬場檢出PRV gE抗體總體陽性率（16.13%）。這表明云南省內(nèi)的PR流行仍然嚴重，因而要提高對PR防控的重視，認真做好預(yù)防控制工作，將可能產(chǎn)生的損失降低到最小。

從不同地區(qū)的檢測結(jié)果來看，玉溪、宣威和西雙版納的PRV野毒感染率較高，表明這3個地區(qū)的PR發(fā)生風(fēng)險較大。從不同季度樣品檢測結(jié)果來看，4個季度的野毒感染率較為接近，說明PR一年四季均可發(fā)生，沒有明顯的季節(jié)性，只是在初春和冬季較為多發(fā)。從不同豬群檢測結(jié)果來看，母豬野毒感染率較高，說明在云南省存在較為嚴重的PR野毒感染。這可能與疫苗質(zhì)量、免疫程序、接種方法和養(yǎng)殖戶對免疫的錯誤認識有關(guān)。保育豬野毒陽性率高可能與母源抗體的干擾有關(guān)，也可能與母豬垂直傳播有關(guān)；仔豬由于免疫系統(tǒng)還沒有發(fā)育成熟，對PRV的抵抗力較弱。因此，母豬和仔豬的PR免疫與預(yù)防工作都應(yīng)該得到重視。

4　結(jié)論

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南省9個地區(qū)規(guī)模豬場的PR免疫抗體陽性率為88.7%，表明總體免疫效果較好；gE抗體陽性率為13.5%，表明云南省仍有一定程度的PR流行；gB抗體陽性率偏高的地區(qū)，gE抗體陽性率較低，說明免疫有助于預(yù)防PR野毒感染；第2季度野毒感染率最高，說明PR多發(fā)于低溫季節(jié)；玉溪、宣威和西雙版納等地區(qū)，以及母豬、保育豬、仔豬和公豬精液的PR病原檢出率較高，表明對于這些地區(qū)、此類豬群，應(yīng)重點加強防控。

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