MLL啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SST基因轉(zhuǎn)化甜菜的抗旱性分析

梁文潔， 張　麗， 郭新勇， 王愛(ài)英， 向本春， 祝建波

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

甜菜是我國(guó)及世界的主要糖料作物之一，其產(chǎn)糖量占世界總產(chǎn)糖量的40%左右。近年來(lái)，我國(guó)甜菜生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)區(qū)域正在向鹽堿、干旱和冷涼地區(qū)擴(kuò)展，因此提高甜菜的抗逆性是保障甜菜生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)[1]。

植物對(duì)干旱的敏感性之一，即表現(xiàn)在因水分缺失而導(dǎo)致滲透脅迫。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生多種機(jī)制來(lái)適應(yīng)這種逆境脅迫，如積累季胺類(甜菜堿)、氨基酸類(脯氨酸)、糖類(海藻糖、果聚糖、山梨糖醇)等[2-3]滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。國(guó)內(nèi)外很多研究證明，將微生物中編碼高聚合度(degree of polymers，簡(jiǎn)稱DP)果糖的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因(SacB基因)轉(zhuǎn)入煙草(Nicotianatobacum)、番茄(LycopersiconesculentumL.)、甜菜(Betavulgaris)、小麥(TriticumaestivumL.)、美麗胡枝子[LespedezaFormosa(Vog.) Koehne.]后，植株的耐旱性和耐鹽性[4-9]均得到明顯的提高。此外，對(duì)菊苣(CichoriumintybusL.)[10]、多年生黑麥草(LoliumperenneL.)[11]和高羊茅(Festucaarundinacea)[12]等植物進(jìn)行干旱處理可使其合成并積累更多的果聚糖。近年來(lái)，有關(guān)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因(1-SST基因、6-SFT基因)可提高植物的耐凍性研究[13-14]比較多，而由1-SST基因編碼的蔗糖：蔗糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶合成的低聚合度(DP=3)果聚糖對(duì)植物抗旱性改良的相關(guān)報(bào)道較少。李慧娟等將1-SST基因轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，使煙草的抗旱性得到了明顯的提高[15]。葉興國(guó)等將1-SST基因轉(zhuǎn)入小麥中發(fā)現(xiàn)，在水分脅迫處理前15 d內(nèi)果聚糖積累量較低，水分脅迫21～28 d果聚糖開(kāi)始積累，隨著復(fù)水后干旱脅迫解除，果聚糖含量下降，低聚果糖的有效積累可提高小麥的抗旱能力[16]。

本研究將洋蔥(Alliumcepa)的蔗糖-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因SST與甜菜根部特異性啟動(dòng)子MLL重組，以pBI121為起始載體，構(gòu)建pBI121-MLL-SST，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甜菜品種STFD4，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱PCR)和逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，簡(jiǎn)稱RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)目的基因是否整合到甜菜并進(jìn)行表達(dá)。將獲得的轉(zhuǎn)基因甜菜和對(duì)照甜菜生根并移栽大田，并將轉(zhuǎn)基因甜菜和野生型甜菜進(jìn)行干旱脅迫處理，比較二者在形態(tài)、葉片相對(duì)含水量、丙二醛(malondialdehyde，簡(jiǎn)稱MDA)含量、相對(duì)電導(dǎo)率和光系統(tǒng)Ⅱ(photosystemⅡ，簡(jiǎn)稱PSⅡ)相對(duì)量子產(chǎn)率等方面的差異，以期為了解SST基因在甜菜根部特異性啟動(dòng)子MLL的驅(qū)動(dòng)下是否具有抗旱性，為今后該基因的研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

室內(nèi)試驗(yàn)于2015年4月至2016年5月在石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，田間試驗(yàn)于2016年5月至2016年11月在石河子大學(xué)試驗(yàn)場(chǎng)基地完成。

1.1　植物材料與菌株

甜菜(STFD4)的種子是由石河子甜菜研究所選育而成的二倍體甜菜授粉系。大腸桿菌TOP10、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101、pGM-T-SST(已克隆洋蔥的蔗糖果糖基轉(zhuǎn)移酶基因)、植物表達(dá)載體pBI121，均由石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保存；TaqDNA聚合酶、植物基因組DNA提取試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、內(nèi)切酶HindⅢ和DraⅢ、T4DNA 連接酶、pGM-T vector及普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；引物合成、序列測(cè)定均由北京華大基因科技股份有限公司完成；其他試劑均為分析純。

1.2　分子生物學(xué)試驗(yàn)材料

內(nèi)切酶、連接酶、Taq酶均購(gòu)于日本TaKaRa公司；pGEM-T vector試劑盒及PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Promega公司。

1.3　基因組DNA的提取

用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡(jiǎn)稱CTAB)法提取甜菜根部的總DNA[17]。

1.4　引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank公布的甜菜組織特異性啟動(dòng)子基因序列(GenBank登錄號(hào)為AX449164.1)，結(jié)合軟件Primer premier 5.0設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)的MLL引物：P1：5′-AAGCTTGTTTG TTAACTGAACTGAACTGTTAATT-3′，P2：5′-CCCGGGCTTT TGAAAATTTTGAAACGCTCAC-3′，酶切位點(diǎn)分別為HindⅢ和XmaⅠ。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸 10 min。SST 引物：P3：5′-CCCGGGCCATGGAATCCAGAG AGATCGAG-3′，P4：5′-GAGCTCTGAGCACCTAACCAAAC AACACA-3′，酶切位點(diǎn)為XmaⅠ和SacⅠ。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。

1.5　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收、克隆及測(cè)序

根據(jù)Promega公司提供的WizardTM DNA Clean-up System回收試劑盒和pGEM-T Easy vector試劑盒中提供的說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收與克隆。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy vector中，陽(yáng)性重組子命名為pGEM-MLL和pGEM-SST。由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序。

1.6　植物表達(dá)載體pBI121-MLL-SST構(gòu)建

用HindⅢ和SacⅠ切下pBI121的35S-Gus，并回收大片段，用HindⅢ和XmaⅠ切下pGEM-MLL中的MLL基因并回收大片段，用XmaⅠ和SacⅠ切下pGEM-SST中的SST基因并回收，然后將大片段與MLL、SST相連，在T4-DNA連接酶的作用下，載體片段與基因片段相連接，即構(gòu)建成植物表達(dá)載體pBI121-MLL-SST，得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α[18]；挑單克隆培養(yǎng)，對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，提取陽(yáng)性單克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒采用凍融法轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌GV3101[18]。

1.7　甜菜的遺傳轉(zhuǎn)化

剪取在預(yù)培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6-BA)培養(yǎng)50～60 d的甜菜葉柄，在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將pBI121-MLL-SST整合到甜菜基因組中，葉柄侵染后接種于鋪有濾紙的共培養(yǎng)基(MS+100 mg/L AS)上暗培養(yǎng) 3 d，之后轉(zhuǎn)接到延遲篩選培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+300 mg/L Cb)中培養(yǎng)4～5 d。然后，在選擇培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+300 mg/L Cb+50 mg/L Kan)中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)抗性小苗時(shí)，將卡那霉素加至100 mg/L，每隔15 d左右進(jìn)行繼代培養(yǎng)1次。待叢生芽長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，切取，分別放入生根培養(yǎng)基(1/2 MS+1.0 mg/L NAA+300 mg/L Cb+50 mg/L Kan)中誘導(dǎo)生根，待根系長(zhǎng)至2～3 cm 時(shí)移栽至花盆。

1.8　轉(zhuǎn)基因甜菜的分子檢測(cè)

采用CTAB法[11]提取甜菜葉片基因組總DNA，以 pGEM-SST質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，野生型甜菜的DNA為陰性對(duì)照，PCR檢測(cè)目標(biāo)基因。用TRNzol法[16]提取陽(yáng)性植株的總RNA，以pGEM-SST質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，相應(yīng)的野生型甜菜為陰性對(duì)照，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

1.9　轉(zhuǎn)pBI121-MLL-SST基因甜菜干旱脅迫試驗(yàn)

選取生長(zhǎng)良好、大小一致的轉(zhuǎn)pBI121-MLL-SST基因甜菜和未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株各3株，充分澆水后進(jìn)行干旱脅迫，此后不再供水，逐漸形成干旱環(huán)境，1個(gè)月后觀察試驗(yàn)結(jié)果，在干旱脅迫后0、10、20、30 d對(duì)其葉片的相對(duì)含水量、丙二醛(malondialdehyde，簡(jiǎn)稱MDA)含量、相對(duì)電導(dǎo)率、光系統(tǒng)Ⅱ光化學(xué)最大量子效率進(jìn)行檢測(cè)[19]。

葉片相對(duì)含水量的測(cè)定：選取同一部位、大小相近的葉片，用直徑為1.2 cm的打孔器打孔，稱取葉片鮮質(zhì)量(m1)后，將其放入平皿中加入蒸餾水，平鋪一層濾紙，使葉片完全浸于水中12 h，待葉片吸水至飽和。從水中將葉片取出，并用濾紙吸除表面水分后稱其質(zhì)量(m2)。最后將葉片放入80 ℃烘箱中，烘干后稱質(zhì)量(m3)。

葉片相對(duì)含水量=[(m1-m3)/(m2-m3)]×100%。

葉片丙二醛含量的測(cè)定：選取同一部位、大小相近的葉片，用直徑為1.0 cm的打孔器打孔稱葉片質(zhì)量至0.1 g，加入 1.5 mL 的5%三氯乙酸(trichloroacetic acid，簡(jiǎn)稱TCA)，充分研磨后12 000 r/min離心10 min；取上清液，加入2 mL 0.067% 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，簡(jiǎn)稱TBA)，充分搖勻后置于100 ℃條件下水浴30 min，分別測(cè)定波長(zhǎng)為450、532、600 nm處的吸光度。

丙二醛含量(μmol/g)=6.45(D532 nm-D600 nm)-0.56D450 nm。

葉片相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定：選取同一部位、大小相近的葉片用紗布拭凈，用直徑為1.0 cm的打孔器打孔，稱葉片質(zhì)量至 0.1 g，放入帶有刻度的試管中，加蒸餾水至10 mL，浸沒(méi)葉片，靜置20 min后用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率，數(shù)值為A；在100 ℃條件下水浴30 min后，放入水中靜置20 min，用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率，數(shù)值為B。

葉片相對(duì)電導(dǎo)率=A/B×100%。

葉片PSⅡ光化學(xué)最大量子效率的測(cè)定：選取同一部位、大小相近的野生型和轉(zhuǎn)基因甜菜葉片，使用儀器DUAL-PAM-100對(duì)PSⅡ光化學(xué)最大量子效率進(jìn)行測(cè)定。其中，有效熒光值為Fv；葉片最大熒光值為Fm；固定熒光值為Fo。

光化學(xué)最大量子效率=Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm。

1.10　數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　PCR擴(kuò)增及序列比對(duì)

以甜菜基因組DNA為模板對(duì)MLL基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳得到大小為1 726 bp特異性擴(kuò)增帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。將片段回收純化后，插入到pGEM-T Easy載體上得到重組質(zhì)粒pGEM-MLL，經(jīng)測(cè)序后，與GenBank上已公布的甜菜根部特異性啟動(dòng)子序列進(jìn)行比較，同源性達(dá)100%。以由本實(shí)驗(yàn)室保存的含有完整的SST基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行SST基因的PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳得到大小為1 938 bp特異性條帶(圖2)，回收后連接到pGEM-T Easy載體上得到重組質(zhì)粒pGEM-SST，經(jīng)測(cè)序分析后，將該序列與GenBank上報(bào)道的IPT基因序列比較，同源性達(dá)100%。

2.2　植物表達(dá)載體的構(gòu)建

從測(cè)序正確的克隆中分別提取pGEM-MLL質(zhì)粒和pGEM-SST質(zhì)粒，用HindⅢ和XmaⅠ消化pGEM-MLL質(zhì)粒產(chǎn)生了大小1 726 bp的小片段；用XmaⅠ和SacⅠ消化pGEM-SST質(zhì)粒；用HindⅢ和SacⅠ消化pBI121質(zhì)粒得到了不含35S-Gus的載體大片段。將酶切克隆載體獲得的2個(gè)小片段和酶切表達(dá)載體pBI121獲得的大片段用T4-DNA連接酶連接構(gòu)建了pBI121-MLL-SST植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α[18]，挑單克隆培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)(圖3、圖4)，提取陽(yáng)性單克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定(圖5、圖6)，將酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒采用凍融法轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌GV3101[18]。

2.3　轉(zhuǎn)基因甜菜的獲得與移栽

甜菜種子經(jīng)過(guò)10% H2O2和0.1%氯化汞消毒后，接種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上(圖7-A)，在(24±2) ℃條件下暗培養(yǎng)2～3 d后發(fā)現(xiàn)，種子消毒干凈，沒(méi)有污染，10 d左右開(kāi)始發(fā)芽，取發(fā)芽的較健壯的甜菜苗，剪掉根部，轉(zhuǎn)移至預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)50～60 d(圖7-B)發(fā)現(xiàn)，甜菜無(wú)菌苗葉片嫩綠，長(zhǎng)勢(shì)良好。剪甜菜的葉柄1 cm左右做外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d(圖7-C)，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)甜菜進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上初步篩選具有抗性的轉(zhuǎn)化植株(圖7-D)，待抗性苗長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，分別轉(zhuǎn)移放入2種生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根(圖7-E)，大約1個(gè)月的時(shí)間2種生根培養(yǎng)基的甜菜均生根，但形態(tài)不同，用吲哚丁酸(indole butyric acid，簡(jiǎn)稱IBA)誘導(dǎo)的根(圖7-F)比較長(zhǎng)，比較細(xì)，而用萘乙酸(1-naphthylacetic acid，簡(jiǎn)稱NAA)誘導(dǎo)的根(圖7-E)比較粗，比較短。煉苗后，移栽到花盆中至成活(圖7-G)，移栽過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用NAA誘導(dǎo)的較粗、較短，根比較容易移栽成活。對(duì)移栽出來(lái)的甜菜進(jìn)行PCR、RT-PCR[18]檢測(cè)目的基因，檢測(cè)結(jié)果(圖8、圖9)表明，獲得能夠正常轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)基因甜菜植株。將RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的植株與對(duì)照甜菜在5月初共同移栽至大田(圖7-H)。

2.4　干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因甜菜形態(tài)和生理指標(biāo)的影響

停止?jié)菜?0 d，野生型植株基部開(kāi)始萎蔫，葉片由下至上開(kāi)始慢慢變黃；20 d，整株萎蔫；30 d，全部葉片干枯死亡。而轉(zhuǎn)基因植株在停止?jié)菜?5 d，基部開(kāi)始萎蔫，20 d葉片由下至上開(kāi)始慢慢變黃；30 d只有部分葉片干枯死亡(圖10)。可見(jiàn)，在干旱脅迫試驗(yàn)中轉(zhuǎn)pBI121-MLL-SST基因甜菜植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱性。

在水分脅迫試驗(yàn)中，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型和轉(zhuǎn)基因甜菜的葉片相對(duì)含水量均有所下降，但野生型甜菜的下降幅度和速度明顯大于轉(zhuǎn)基因甜菜(圖11-A)；野生型和轉(zhuǎn)基因甜菜的葉片MDA含量均呈上升趨勢(shì)，但野生型甜菜的上升幅度和速度明顯大于轉(zhuǎn)基因甜菜(圖11-B)；野生型和轉(zhuǎn)基因甜菜細(xì)胞膜的受傷害率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，但野生型甜菜傷害率的上升幅度和速度明顯高于轉(zhuǎn)基因甜菜(圖11-C)；野生型和轉(zhuǎn)基因甜菜的Fv/Fm值均有所下降，但轉(zhuǎn)基因甜菜的下降幅度顯著低于野生型甜菜(圖11-D)，可見(jiàn)在水分脅迫條件下SST基因的過(guò)量表達(dá)減輕了甜菜葉片 PSⅡ 受到的逆境傷害。以上生理指標(biāo)的變化進(jìn)一步說(shuō)明，在水分脅迫下轉(zhuǎn)pBI121-MLL-SST基因甜菜的抗旱性優(yōu)于野生型甜菜。

3　結(jié)論與討論

本研究將參與果聚糖合成的蔗糖-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因即SST基因，與根部特異性表達(dá)啟動(dòng)子MLL組合，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入甜菜中，觀察轉(zhuǎn)基因甜菜的抗旱性。結(jié)果表明，在干旱脅迫下，未經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的甜菜植株膜脂可能發(fā)生了過(guò)氧化作用，加劇活性氧(reactive oxygen species，簡(jiǎn)稱ROS)的產(chǎn)生和富集，這些有毒害作用的分子破壞了膜結(jié)構(gòu)和生物大分子，并且通過(guò)受損傷的膜滲透細(xì)胞內(nèi)溶物質(zhì)，造成質(zhì)膜的通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致了大量的電解質(zhì)外滲[3]。相比之下，轉(zhuǎn)pBI121-MLL-SST基因甜菜植株在一定程度上所受到的傷害較小。果聚糖能維持脂質(zhì)體在溫度變化和干旱條件下相態(tài)的改變，脂類相態(tài)的改變可提高膜的通透性，修復(fù)脅迫對(duì)膜的損害[20-21]。SST基因編碼的低聚合度果聚糖的積累與轉(zhuǎn)基因甜菜抗旱性的提高有關(guān)，這與SacB基因編碼的高聚合度果聚糖通過(guò)促進(jìn)根的生長(zhǎng)來(lái)提高植物抗旱性的試驗(yàn)結(jié)果[20，22]相一致。

植物根部在抗旱上有重要的作用。本研究通過(guò)根部特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的轉(zhuǎn)SST基因甜菜的抗旱性比較試驗(yàn)，證實(shí)在干旱條件下，轉(zhuǎn)pBI121-MLL-SST基因各株系與對(duì)照相比，更能減少水分的流失，更有效地提高了抗氧化物酶的活性，從而使轉(zhuǎn)pBI121-MLL-SST基因甜菜植株獲得更高的抗旱性；根部特異表達(dá)啟動(dòng)子MLL驅(qū)動(dòng)下SST基因的轉(zhuǎn)化甜菜的抗旱性得到進(jìn)一步的提高。說(shuō)明在缺水條件下，根部特異性表達(dá)啟動(dòng)子MLL驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)SST基因甜菜在干旱逆境脅迫中更能穩(wěn)定的順應(yīng)以及度過(guò)干旱逆境，同時(shí)證實(shí)了該轉(zhuǎn)基因方法在甜菜新品種培育中具有潛在的應(yīng)用性。

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