秋水仙素誘導(dǎo)丹參多倍體研究進(jìn)展

白英豪， 張曉麗，2， 李明軍，2

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術(shù)研究中心/河南省綠色藥材生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453007)

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge.)是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，根部色紅可入藥，具有活血化瘀、清心止痛等功效[1]，主要分布于我國(guó)遼寧省、河北省、河南省、甘肅省、四川省等地區(qū)，根據(jù)產(chǎn)地、性狀不同有白花丹參、紫花丹參、南丹參、川丹參、甘肅丹參、山東丹參、裕丹參等許多品種。隨著丹參在臨床上越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，其藥用價(jià)值日漸被人們重視，而生產(chǎn)中丹參良種短缺、種性退化，產(chǎn)量和品質(zhì)下降，因而培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新品種勢(shì)在必行。

多倍體現(xiàn)象普遍存在于植物界中，許多重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物都是多倍體，而許多物種在進(jìn)化過(guò)程中都經(jīng)歷了多倍化與“多倍體二倍化”過(guò)程[2]。多倍體植物具有營(yíng)養(yǎng)器官的巨大性[3]、抗逆性增強(qiáng)、生長(zhǎng)率提高、有效成分含量增加等特點(diǎn)，而這些特點(diǎn)完全符合優(yōu)質(zhì)藥材的要求，因而染色體多倍化成為藥用植物育種的重要方向之一。自然界多倍體雖然分布廣泛，但數(shù)量有限[4]，因此，需要人工誘導(dǎo)，利用秋水仙素是誘導(dǎo)植物多倍體最常用的方法之一。秋水仙素可阻礙細(xì)胞分裂中期紡錘絲的形成，使有絲分裂被迫中斷[5]，但細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)并不分離，從而使染色體加倍。

丹參的染色體組基數(shù)較小(x=8)，誘導(dǎo)多倍體易于成功，且染色體計(jì)數(shù)較為容易；為異花授粉植物，有很高的遺傳多樣性，易于篩選優(yōu)良株系；并可行無(wú)性繁殖，規(guī)避了多倍化后的不育問(wèn)題；以塊根為藥用部位，可以充分利用多倍化所造成的營(yíng)養(yǎng)器官的巨大性而提高產(chǎn)量，這些特征使丹參成為多倍體育種的典型材料，近年來(lái)，有學(xué)者對(duì)丹參進(jìn)行多倍化遺傳改良，高山林等獲得了丹參同源四倍體[6]，并選育出四倍體優(yōu)良品系61-2-22[7]；段英姿獲得了南丹參的不同多倍體株系[8]；陳力等對(duì)白花丹參進(jìn)行了同源四倍體誘導(dǎo)[9]；劉竟飛等通過(guò)雜交后誘導(dǎo)獲得了丹參異源四倍體[10]；吳順等對(duì)紫花丹參進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)等[11]。眾多研究中，秋水仙素是最常用的多倍體誘變劑，筆者對(duì)秋水仙素誘導(dǎo)不同品種丹參多倍體的方法及多倍體鑒定進(jìn)行綜述，以期為丹參多倍體的誘導(dǎo)流程提供理論指導(dǎo)。

1　秋水仙素誘導(dǎo)方法

秋水仙素誘導(dǎo)法分為活體誘導(dǎo)、離體誘導(dǎo)2種[12]，活體誘導(dǎo)包括浸種法、生長(zhǎng)點(diǎn)滴定法、涂抹法；離體誘導(dǎo)包括浸泡法、培養(yǎng)基中添加秋水仙素的方法。相對(duì)來(lái)說(shuō)，活體誘導(dǎo)易于實(shí)施，多用于基層生產(chǎn)實(shí)踐中，但各種方法都有一定的不足，如浸種法直接接觸秋水仙素，毒害作用過(guò)強(qiáng)；涂抹法不易充分接觸作用部位等，總體表現(xiàn)為誘導(dǎo)率較低、嵌合體現(xiàn)象較嚴(yán)重，且誘導(dǎo)后不易篩選多倍體，很難大量獲得多倍體材料，即使獲得多倍體穩(wěn)定性也較差，容易受環(huán)境影響而發(fā)生回復(fù)突變，所以一般選用離體誘導(dǎo)法。離體誘導(dǎo)中，吳順等將浸泡法與培養(yǎng)基添加法相結(jié)合進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，操作流程較復(fù)雜[11]，眾多研究者采用培養(yǎng)基中添加秋水仙素的方法誘導(dǎo)丹參多倍體[6，8-10，13]，誘導(dǎo)流程如下：首先確定誘導(dǎo)對(duì)象，即外植體，可以是試管苗在無(wú)菌條件下切成的帶芽莖段或葉片，可以是誘導(dǎo)獲得的愈傷組織，也可以是經(jīng)過(guò)次氯酸鈉滅菌的種子，也可以是株高為1.5～2.0 cm的幼苗；然后確定秋水仙素濃度梯度及處理時(shí)間梯度，一般各為3～4個(gè)水平，進(jìn)行全面試驗(yàn)，根據(jù)設(shè)置的濃度梯度配制誘導(dǎo)培養(yǎng)基，即快繁(或繼代)培養(yǎng)基+不同濃度秋水仙素；將外植體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，根據(jù)設(shè)置的時(shí)間梯度，在處理不同時(shí)間后轉(zhuǎn)入正?？旆?或繼代)培養(yǎng)基，繼代3次后進(jìn)行倍性鑒定，并確定最佳秋水仙素處理組合。

2　影響秋水仙素誘導(dǎo)丹參多倍體效果的因素

2.1　選擇材料

由于秋水仙素是作用于正在分裂的細(xì)胞，因此，應(yīng)選擇分裂旺盛的組織作為誘變材料，如莖尖、根尖、幼葉、頂芽等[14]，外植體可選擇種子、幼苗、愈傷組織、胚狀體、懸浮細(xì)胞系、小孢子、原生質(zhì)體或單細(xì)胞等[15]，不同植物誘導(dǎo)多倍體的最適宜外植體不同，同一種植物也可選用多種外植體。處理材料對(duì)誘導(dǎo)效果有很大影響，并且還影響處理時(shí)間和濃度。段英姿利用培養(yǎng)基中添加秋水仙堿的方法對(duì)幼苗、葉片、愈傷組織3種外植體進(jìn)行染色體誘導(dǎo)加倍，結(jié)果表明，幼苗在秋水仙堿濃度為40 mg/L、處理時(shí)間為5 d時(shí)加倍效果最好，達(dá)到11%，而葉片(預(yù)培養(yǎng)7 d)和愈傷組織用15 mg/L秋水仙堿處理7 d時(shí)加倍效果最好，達(dá)到33.33%[8]，表明早期外植體的加倍效果比成苗后要好，其中葉片的培養(yǎng)時(shí)間較短，是最好的外植體。

2.2　處理時(shí)間及濃度

一般來(lái)說(shuō)，秋水仙素濃度越高，處理時(shí)間就要相應(yīng)越短一些，反之亦然。處理時(shí)間較短、濃度較低，誘導(dǎo)率會(huì)較低；隨著時(shí)間延長(zhǎng)、濃度升高，誘導(dǎo)率會(huì)上升；時(shí)間和濃度增加到一定程度后，死亡率會(huì)越來(lái)越高，因此誘導(dǎo)率會(huì)急劇下降，這就涉及到秋水仙素的毒害作用。毒害作用不僅會(huì)降低誘導(dǎo)率，還會(huì)抑制根的生長(zhǎng)和不定芽的分化，甚至使外植體在繼代時(shí)褐化死亡，因此，要嚴(yán)格控制秋水仙素濃度和處理時(shí)間，選擇最佳的處理組合。對(duì)于大多數(shù)植物，濃度一般設(shè)置在0.01%～0.40%，處理時(shí)間多為2～6 d[16]。丹參最佳處理組合見(jiàn)表1。

由此可見(jiàn)，秋水仙素處理時(shí)間及濃度受誘變材料影響很大，若為幼芽則選擇低濃度長(zhǎng)時(shí)間；若為葉片則選擇低濃度相對(duì)短的時(shí)間；若為種子，由于有種皮保護(hù)，應(yīng)選擇高濃度，而時(shí)間就相應(yīng)更短?？偟膩?lái)說(shuō)，誘導(dǎo)丹參的秋水仙素濃度要低，一般水平為0.01%，這與丹參本身的試管苗生長(zhǎng)特點(diǎn)有關(guān)，如莖相對(duì)菊花、地黃等植物較細(xì)弱。

表1　秋水仙素誘導(dǎo)丹參多倍體實(shí)例

2.3　其他因素

溫度對(duì)誘導(dǎo)效果也有一定的影響，一般設(shè)置溫度為18～25 ℃，在此溫度下細(xì)胞分裂旺盛，有利于多倍體誘導(dǎo)[3]，而高溫對(duì)處理不利，處理后會(huì)影響植株生長(zhǎng)。光照也會(huì)影響誘導(dǎo)率，因?yàn)榍锼伤匾?jiàn)光易分解，因此，采用浸泡法，一般在暗處進(jìn)行。由于二甲基亞砜能減輕秋水仙素的毒害作用，降低嵌合體的發(fā)生率[17]，并可以促進(jìn)秋水仙素滲透到植物組織中，常與秋水仙素混合使用以提高誘導(dǎo)率。

3　丹參多倍體的鑒定方法

對(duì)丹參進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)后必須進(jìn)行鑒定，以篩選出多倍體株系。常用的鑒定方法有形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、染色體計(jì)數(shù)法鑒定、同工酶鑒定。

3.1　形態(tài)學(xué)鑒定

多倍體植物通常表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)器官的巨大性，以及某些外部形態(tài)的改變。高山林等比較丹參四倍體與二倍體農(nóng)藝性狀發(fā)現(xiàn)，四倍體植株葉型改變，葉片增大、增厚、濃綠，莖桿粗壯，根部藥材粗大，植株更高，花序縮短等，這些特征都可以作為鑒定多倍體的依據(jù)[6]；陳力等觀察發(fā)現(xiàn)，四倍體白花丹參在株高、冠幅、葉片大小、葉片厚度、葉柄絨毛、花、花藥大小等方面都明顯大或高于原二倍體[9]；吳順等發(fā)現(xiàn)，多倍體丹參葉片更為肥大，出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，根粗色深[11]。該方法簡(jiǎn)便直觀，但外部形態(tài)可能受環(huán)境的影響，所以需要結(jié)合其他鑒定方法。

3.2　細(xì)胞學(xué)鑒定

多倍體植物的氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞大小、花粉粒大小等細(xì)胞學(xué)特征與二倍體有顯著差異。房翠萍等研究發(fā)現(xiàn)，多倍體丹參的氣孔密度顯著小于二倍體，氣孔平均長(zhǎng)寬比二倍體大，保衛(wèi)細(xì)胞明顯大于二倍體[13]；陳力等研究發(fā)現(xiàn)，四倍體與二倍體白花丹參的花粉粒大小有顯著差異[9]。該方法可以作為多倍體鑒定的輔助指標(biāo)。

3.3　染色體計(jì)數(shù)法鑒定

該方法直觀準(zhǔn)確，是應(yīng)用最廣泛的多倍體鑒定方法。鑒定時(shí)取根尖、莖尖等分裂旺盛的組織，經(jīng)過(guò)預(yù)處理、固定、解離、染液染色、壓片等步驟制成細(xì)胞壓片，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。陳力等用該方法對(duì)誘導(dǎo)后丹參株系進(jìn)行染色體核型分析，確定獲得了16株同源四倍體[9]；吳順等利用根尖壓片確定變異植株的染色體已加倍，并發(fā)現(xiàn)部分植株為嵌合體[11]。

3.4　同工酶鑒定

染色體加倍后同工酶譜會(huì)發(fā)生變化，段英姿比較了南丹參多倍體與二倍體的過(guò)氧化物酶譜與酯酶譜，發(fā)現(xiàn)譜帶數(shù)目與酶活性強(qiáng)弱都發(fā)生了變化，總體表現(xiàn)為多倍體酶活性更高且多出若干特征性譜帶[8]。

4　展望

迄今為止，人工誘導(dǎo)多倍體在植物特別是藥用植物育種方面已得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，三七、決明、柴胡、太子參、何首烏、白術(shù)、黃芪、桔梗、川貝母、菊花腦、懷牛膝、枸杞、當(dāng)歸等都進(jìn)行了多倍化嘗試[18]。對(duì)丹參進(jìn)行多倍體育種已有許多學(xué)者進(jìn)行了研究，但誘導(dǎo)方法還是局限于秋水仙素，且試驗(yàn)有一定的重復(fù)性，而秋水仙素對(duì)植物材料和試驗(yàn)者有很強(qiáng)的毒害作用，因此，尋找新型、廉價(jià)、低毒、誘導(dǎo)率高的化學(xué)試劑或其他誘導(dǎo)方法是我們研究的目標(biāo)。目前，某些新的微管抑制劑，如戊炔草胺、安磺靈、氟樂(lè)靈等在多倍體誘導(dǎo)中開(kāi)始使用[19]，黃群策等還利用氮離子注入來(lái)促進(jìn)秋水仙素的誘導(dǎo)效果[20]，這些都是有意義的探索。同時(shí)，在多倍體鑒定方法上，也需要力求簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，比如流式細(xì)胞儀鑒定法以及利用分子標(biāo)記技術(shù)、原位雜交技術(shù)[21]等分子水平的鑒定方法已得到越來(lái)越多的應(yīng)用。相關(guān)研究者利用遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)來(lái)測(cè)定葉片溫度，以此來(lái)迅速而準(zhǔn)確地鑒別多倍體[22]；韓毅科等利用染色中心直徑和異染色質(zhì)數(shù)目不同來(lái)鑒定黃瓜多倍體[23]；郭啟高等利用高溫、低溫脅迫來(lái)判斷西瓜倍性[24]；還有學(xué)者以待鑒定誘導(dǎo)植株為母本，以二倍體植株為父本進(jìn)行雜交，以子代的育性來(lái)判斷母本倍性，我們需要更多類(lèi)似的嘗試。

目前，主要獲得的是丹參四倍體，四倍體可以作為母本和二倍體父本進(jìn)行雜交來(lái)獲得三倍體丹參，從而同時(shí)發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)和多倍體優(yōu)勢(shì)；國(guó)外有報(bào)道，利用多倍體植物減數(shù)分裂時(shí)的聯(lián)會(huì)紊亂，來(lái)獲得只有1條或數(shù)條染色體加倍的花粉，然后利用花粉培養(yǎng)和秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍獲得只有1對(duì)或幾對(duì)染色體加倍的非整倍體，這樣就獲得了大量遺傳基礎(chǔ)不同的表型，通過(guò)篩選就可能獲得產(chǎn)量品質(zhì)等性狀優(yōu)于原四倍體的株系。綜上所述，秋水仙素誘導(dǎo)丹參多倍體并不是終點(diǎn)，而可以作為遺傳育種的起點(diǎn)，具有更深層次的意義。

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