多年連作土壤中棉花根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)

喬清華 ，張傳云 ，袁哲誠(chéng) ，王芙蓉 *，張軍

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250100；2.山東棉花研究中心/農(nóng)業(yè)部黃淮海棉花遺傳改良與栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250100）

1904年德國(guó)生物學(xué)家Hiltner首先提出根際的概念[1]，根際是根周?chē)芨绊懙?個(gè)小區(qū)域內(nèi)的土壤[2-3]。根際是植物和數(shù)百萬(wàn)計(jì)的土壤微生物相互作用的主要場(chǎng)所[4]，是植物-土壤-微生物相互作用，并且進(jìn)行物質(zhì)能量交換和信號(hào)交流的1個(gè)重要的界面。根際微生物可以通過(guò)改變植物細(xì)胞代謝過(guò)程中的滲透作用、信號(hào)交流、酶的活性等影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生物非生物脅迫抗性[5-8]。例如根際促生菌可以直接或者間接為植物提供生長(zhǎng)發(fā)育所需的磷和氮[9-13]，分泌植物激素調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育[14-17]，提高植物對(duì)生物和非生物脅迫的抵抗能力[18-20]。另一方面，植物本身通過(guò)落葉、根系分泌物等形式向土壤中輸入物質(zhì)能量和信號(hào)調(diào)節(jié)根際環(huán)境，從而改變根際微生物的群落結(jié)構(gòu)[21]。研究表明，植物通過(guò)光合作用固定的碳至少有21%通過(guò)根系分泌物等方式輸入到土壤中，從而影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)[22]。已經(jīng)有大量的研究表明，植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)受生長(zhǎng)環(huán)境、品種特性和發(fā)育時(shí)期等多種因素的影響[23-25]。

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，是天然纖維的主要來(lái)源。連作障礙引發(fā)的棉花大面積減產(chǎn)在我國(guó)主產(chǎn)棉區(qū)普遍存在。連作障礙是植物-土壤-微生物之間長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果。了解連作土壤中棉花根際微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)人工干預(yù)棉花根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、適當(dāng)調(diào)整棉花的生理周期、提高棉花對(duì)土傳性致病菌的抗性或抑制土傳致病菌的定殖具有重要意義。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)多年棉花連作土中棉花不同發(fā)育時(shí)期的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，分析連作土壤中不同發(fā)育時(shí)期的棉花根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，探明連作土壤中棉花根際細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為克服連作障礙、促進(jìn)棉花生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

棉花材料選用陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張?zhí)煺娼淌谔峁?/p>

棉花多年連作土取樣于山東棉花研究中心臨清試驗(yàn)站棉田地表以下15～30 cm處土層。為了使大田土土質(zhì)疏松易于取樣，將大田土與滅菌后的細(xì)砂以質(zhì)量比2∶1混勻后使用。

1.2　棉花種植和取樣

種子脫絨后用10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的過(guò)氧化氫浸泡1 h進(jìn)行消毒，然后用滅菌水反復(fù)沖洗3～5次。再用滅菌水浸泡12 h左右，種子吸足水后將其移至鋪有滅菌濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿里，28℃避光培養(yǎng)12～24 h。種子萌發(fā)后種植到裝有大田土的花盆中放于28℃組培室育苗。待幼苗破土后轉(zhuǎn)移到預(yù)先消毒過(guò)的溫室中培養(yǎng)。每3 d澆1次滅菌水，幼苗期每次每盆500 mL，蕾期和花期每次每盆1 000 mL。

分別在幼苗期、蕾期、花期取樣。將花盆倒扣，倒出土后輕輕抖動(dòng)棉株，抖落多余的土壤，留下附著在根表面1 mm左右的根際土。將根剪下放于裝有滅菌水的50 mL離心管中，用滅菌水反復(fù)沖洗后取出根，將根際土混懸液以104r·min－1離心15 min，倒掉上清液，沉淀液經(jīng)液氮速凍，于－80℃冷凍備用。非根際土為不種植棉花的花盆中距土表6～15cm的土壤。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3　DNA提取與測(cè)序分析

所獲取的土壤樣品DNA提取、檢測(cè)和樣品檢測(cè)合格后建庫(kù)測(cè)序以及下機(jī)數(shù)據(jù)過(guò)濾分析由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

數(shù)據(jù)過(guò)濾采取按窗口去低質(zhì)量的方法，設(shè)置30 bp為窗口長(zhǎng)度，如果窗口平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截除末端序列，移除最終長(zhǎng)度低于原始長(zhǎng)度75%的片段；去除接頭污染的片段（接頭序列與片段序列有15 bp的重疊，允許錯(cuò)配數(shù)為3；去除含N的片段；去除低復(fù)雜度的片段（片段中某個(gè)堿基連續(xù)出現(xiàn)的長(zhǎng)度≥10 bp）。

序列拼接使用軟件FLASH （Fast length adjustment of short reads，V1.2.11），利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)片段組裝成1條序列。最小匹配長(zhǎng)度為15 bp，重疊區(qū)域允許錯(cuò)配率為0.1。

利用軟件 USEARCH（V7.0.1090）將拼接好的片段聚類(lèi)為運(yùn)算分類(lèi)單位 （Operational taxonomic unit，OTU)。得到OTU代表序列后，通過(guò)RDP classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)（Greengene）比對(duì)進(jìn)行物種注釋?zhuān)眯哦乳撝翟O(shè)置為0.5。根據(jù)OTU在每個(gè)樣品的豐度文件，計(jì)算每個(gè)樣品或組別具有的OTU（不考慮OTU豐度，只考慮 OTU有無(wú)），通過(guò) R語(yǔ)言（V3.0.3）中的VennDiagram包制作Venn圖，并找出樣品間或組間共有與特有的OTU。

α多樣性指數(shù) Observed species(Sobs)、Chao、Shannon稀釋曲線(xiàn)是利用已測(cè)得序列中已知的各種OTU的相對(duì)比例，來(lái)計(jì)算抽取n個(gè)（n小于測(cè)得Reads序列總數(shù)）Tags時(shí)各Alpha指數(shù)的期望值，然后根據(jù)1組n值（一般為1組小于總序列數(shù)的等差數(shù)列，本項(xiàng)目公差為1 000）與其相對(duì)應(yīng)的Alpha指數(shù)的期望值繪制曲線(xiàn)。通過(guò)mothur軟件（V1.31.2）計(jì)算樣品的Alpha多樣性指數(shù)值并用R軟件做出相應(yīng)的稀釋曲線(xiàn)圖。計(jì)算公式參考：http://www.mothur.org/wiki/Calculators.

Beta多樣性通過(guò)QIIME（V1.80）進(jìn)行。由于不同樣品的測(cè)序深度不一樣，需要對(duì)每個(gè)樣品的序列數(shù)進(jìn)行統(tǒng)一。每個(gè)樣品按所有樣品中序列數(shù)最少的樣品的序列數(shù)隨機(jī)抽取序列，生成新的OTU table biom文件，并用該文件計(jì)算Beta多樣性距離。

2　結(jié)果與分析

2.1　測(cè)序結(jié)果

圖1　根際和非根際細(xì)菌共有和特有的OTU數(shù)目Fig.1　Common and special OTU numbers between rhizosphere and bulk soil bacterial community

在苗期、蕾期、花期收集棉花根際土和非根際土，利用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)土壤中的細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。共得到2 037 056對(duì)高質(zhì)量的reads，組裝成2 025 475條tags。拼接后的序列經(jīng)過(guò)優(yōu)化后在97%的相似度下聚類(lèi)為11 336個(gè)用于物種分類(lèi)的OTU （表S1；注：表S1～7和圖S1～2請(qǐng)參見(jiàn)本刊網(wǎng)站電子版，印刷版省略）。根際細(xì)菌OTU數(shù)量極顯著高于非根際（P＜0.01），并且隨著發(fā)育時(shí)期的變化，棉花根際細(xì)菌的特異性O(shè)TU比例逐漸增加（圖1），花期根際特有的OTU數(shù)量最高。不同發(fā)育時(shí)期之間的根際細(xì)菌OTU數(shù)量沒(méi)有顯著差異。

2.2　棉花不同發(fā)育時(shí)期根際微生物的群落組成

圖2　棉花不同發(fā)育時(shí)期根際和非根際樣品中細(xì)菌群落組成Fig.2　Bacterial community composition in rhizosphere and bulk soil during different development stage

棉花不同發(fā)育時(shí)期根際細(xì)菌各門(mén)的相對(duì)豐度存在差異，變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、浮霉 菌 門(mén) （Planctomycetes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）這4門(mén)細(xì)菌的豐度占整個(gè)細(xì)菌群落的73.25%～77.20%，在各時(shí)期棉花根際細(xì)菌群落中占主導(dǎo)地位，其中變形菌門(mén)的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于其他菌門(mén)，為30.44%～32.34%（圖2、表S2）。每個(gè)菌門(mén)的主導(dǎo)菌綱或主導(dǎo)菌目（相對(duì)豐度＞1%）在不同發(fā)育時(shí)期的根際土中相同。其中酸桿菌門(mén)的主導(dǎo)菌綱為Chloracidobacteria、Acidobacteria-6，約占酸桿菌門(mén)的 14.28%～15.00%；擬桿菌門(mén)的主導(dǎo)菌綱為Saprospirae、Cytophagia，約占擬桿菌門(mén)的8.94%～10.23%；浮霉菌門(mén)的主導(dǎo)菌綱為 Planctomycetia、Phycisphaerae，約占浮霉菌門(mén)的13.97%～15.21%；變形菌門(mén)的主導(dǎo)菌綱為 Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria，約為變形菌門(mén)的30.22%～32.18%（表 S3）。

酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、浮霉菌門(mén)、變形菌門(mén)在根際與非根際土中的相對(duì)豐度存在顯著差異且差異較大（P＜0.05，平均差值＞0.03），為根際和非根際細(xì)菌群落中的主要差異菌門(mén)（表S2）。與非根際土相比，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)在根際土中的相對(duì)豐度顯著降低，其他菌門(mén)相對(duì)豐度顯著升高。并且各菌門(mén)相對(duì)豐度升高或降低程度不同。例如3個(gè)時(shí)期平均酸桿菌門(mén)在根際土中的相對(duì)豐度比非根際土中高0.083 4±0.018 6，而擬桿菌門(mén)在根際土中的相對(duì)豐度比非根際土中高0.031 4±0.012 1。厚壁菌門(mén)在根際土中的相對(duì)豐度比非根際土中低0.1117±0.0070，變形菌門(mén)在根際土中的相對(duì)豐度比非根際土中低0.114 0±0.008 4（表 S2）。

與非根際土相比，棉花根際土中各菌屬相對(duì)豐度增加或降低量存在差異。我們對(duì)與非根際土相比相對(duì)豐度顯著增加或降低的菌屬進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Candidatus_Nitrososphaera、Steroidobacte等菌屬在根際土中的相對(duì)豐度顯著高于非根際土（P＜0.05）， 而Lactococcus、Rhodoplanes等菌屬在根際土中的相對(duì)豐度顯著低于非根際土。我們分析了在不同發(fā)育時(shí)期根際土中受到棉花根系的促進(jìn)且與非根際土相比相對(duì)豐度差值較大的菌屬（表1），發(fā)現(xiàn)3個(gè)發(fā)育時(shí)期受到顯著促進(jìn)作用的菌屬基本相同。但是不同菌屬受到的促進(jìn)作用隨發(fā)育時(shí)期的變化不同，例如Candidatus_Nitrososphaera、Steroidobacter、Planctomyces等菌屬在根際與非根際土中的相對(duì)豐度差值隨發(fā)育時(shí)期的變化逐漸升高，而Rubrivivax、Niastella在根際與非根際土中的相對(duì)豐度差值則隨發(fā)育時(shí)期的變化逐漸降低，Novosphingobium、Chitinophaga在根際與非根際土中的相對(duì)豐度差值在蕾期最高。棉花對(duì)細(xì)菌的抑制作用在花期相對(duì)較弱。在花期根際土中相對(duì)豐度升高的菌屬數(shù)量高于相對(duì)豐度降低的菌屬數(shù)量（表S4）。

2.3　棉花不同發(fā)育時(shí)期的根際細(xì)菌α-多樣性變化

用 Observed species（Sobs）、Chao 以及 Shannon指數(shù)衡量不同土壤的α-多樣性。其中Sobs、Chao可以反映群落中物種的豐富度，而Shannon受群落中物種豐富度（Species richness）和物種均勻度 （Species evenness）的影響。此外，Sobs和Chao指數(shù)對(duì)應(yīng)的稀釋曲線(xiàn)還可以反映樣品測(cè)序深度是否已經(jīng)基本覆蓋樣品中所有的物種。由稀釋曲線(xiàn)可以看出本試驗(yàn)的測(cè)序深度符合要求（表S5，圖 S1、S2）。

由結(jié)果可以看出，棉花根際細(xì)菌群落的α-多樣性極顯著大于非根際土（P＜0.01）。棉花不同發(fā)育時(shí)期的根際細(xì)菌α-多樣性隨著發(fā)育時(shí)期變化逐漸降低，但是差異不顯著（P＞0.05）。棉花根際和非根際細(xì)菌的Sobs和Chao指數(shù)在花期低于蕾期，而根際細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)花期高于蕾期，非根際細(xì)菌Shannon指數(shù)低于蕾期，推測(cè)棉花在花期對(duì)根際細(xì)菌的均勻度有促進(jìn)作用（表 S6）。

2.4　棉花不同發(fā)育時(shí)期根際細(xì)菌的β-多樣性

為了比較不同土壤樣品間的細(xì)菌群落多樣性差異，我們用Bray-Curtis指數(shù)對(duì)樣品的β-多樣性進(jìn)行分析。Bray-Curtis距離是反映2個(gè)群落之間差異性的常用指標(biāo)，不考慮序列間的進(jìn)化距離，只考慮2個(gè)樣品中物種的存在性。Bray-Curtis值越大，表示2個(gè)樣品間β-多樣性越大。

對(duì)樣品間多樣性分析表明，不同發(fā)育時(shí)期根際細(xì)菌群落間存在差異（表S7）。棉花根際與非根際之間的細(xì)菌群落多樣性差異隨著發(fā)育時(shí)期的變化極顯著升高（P＜0.01，圖4A），花期與蕾期的根際細(xì)菌群落差異顯著大于蕾期與苗期（P＜0.05，圖4B）。說(shuō)明棉花對(duì)根際微生物的影響隨著發(fā)育時(shí)期的變化逐漸增加，在花期對(duì)根際細(xì)菌群落的影響比苗期和蕾期大。

表1　各發(fā)育時(shí)期顯著受棉花根系促進(jìn)和抑制的菌屬Table 1　Bacterial genera inhibited or promoted by cotton root in each development stages %

3　討論

3.1　棉花根際細(xì)菌群落組成及其與非根際細(xì)菌群落之間的差異

圖3　棉花不同發(fā)育時(shí)期根際和非根際土壤中Sobs、Chao以及Shannon指數(shù)變化Fig.3　Change of Sobs,Chao and Shannon indexes in rhizosphere and bulk soil during different development stages

圖4　棉花不同發(fā)育時(shí)期根際與非根際細(xì)菌群落間β-多樣性和不同發(fā)育時(shí)期間的β-多樣性比較Fig.4　β-diversity between rhizosphere and bulk soil in different development stages and β-diversity between different development stages

已有研究表明，植物可以與土壤和微生物相互作用，通過(guò)改變土壤的理化性質(zhì)，釋放根系分泌物等方式與根際微生物進(jìn)行復(fù)雜的相互作用，調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)，形成其特有的根際微生物。本研究結(jié)果表明，在棉花多年連作土壤中變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)這4大菌門(mén)為棉花根際細(xì)菌群落的主導(dǎo)菌門(mén)，并且在不同發(fā)育時(shí)期每個(gè)菌門(mén)的主導(dǎo)菌綱相同。其中變形菌門(mén)為常見(jiàn)的土壤中相對(duì)豐度較高的菌門(mén)，其相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于其他菌門(mén)。酸桿菌門(mén)是廣泛存在于植物根際的主導(dǎo)菌門(mén)，能夠降解多糖，所以可能在植物根際的碳循環(huán)中發(fā)揮重要作用[26]。浮霉菌門(mén)可能與氨的氧化有關(guān)[27]，但是并不是植物根際細(xì)菌群落中常見(jiàn)的主導(dǎo)菌門(mén)。與其他植物相比，浮霉菌門(mén)在棉花根際土壤中的相對(duì)豐度較高，可能與棉花的某些生理特性有關(guān)。棉花根際與非根際細(xì)菌群落差異主要集中在4個(gè)主導(dǎo)菌門(mén)和厚壁菌門(mén)這5個(gè)菌門(mén)，并且酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)受到棉花根系促進(jìn)，在根際土中的相對(duì)豐度高于非根際土，而厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)受到棉花根系抑制，在根際土中的相對(duì)豐度低于非根際土。這與之前的研究結(jié)果——長(zhǎng)期連作土壤中厚壁菌門(mén)受到植物根系的顯著抑制一致[28]。Dombrowski猜測(cè)，在寄主植物根系中豐度普遍升高的菌種是對(duì)寄主植物有特殊促進(jìn)作用的菌種[29]。因此，我們推測(cè)酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)中的某些菌群對(duì)棉花生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用。

3.2　多年棉花連作大田土中棉花根際細(xì)菌群落的多樣性高于非根際

已有研究表明，棉花連作導(dǎo)致土壤肥力下降，土壤酶活力、細(xì)菌群落物種豐富度降低[30-31]。張偉等的研究表明，棉花長(zhǎng)期連作使土壤中的細(xì)菌群落物種豐富度降低，而多樣性和均勻度指數(shù)增大[32]。本研究表明，與非根際土相比，棉花根際細(xì)菌群落的物種豐富度顯著增加，并且豐度受到促進(jìn)的菌屬數(shù)量遠(yuǎn)高于受到抑制的菌屬數(shù)量。推測(cè)多年棉花連作土壤中的微生物由于受到棉花根系長(zhǎng)期的選擇作用，其物種豐富度降低；多年棉花連作大田土中的細(xì)菌群落主要由受棉花根系促進(jìn)的菌屬組成，所以多年棉花連作大田土中的棉花根際土壤中細(xì)菌群落多樣性高于非根際土，這與Li等對(duì)黑胡椒連作土壤中根際和非根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究結(jié)果一致[28]。

3.3　發(fā)育時(shí)期對(duì)棉花根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

Baudoin等認(rèn)為隨著植物發(fā)育時(shí)期的變化，植物向土壤中輸入的根系分泌物的數(shù)量和質(zhì)量存在差異，導(dǎo)致植物不同發(fā)育時(shí)期根際微生物的差異[33]。隨后不斷有研究結(jié)果證明植物根際微生物受發(fā)育時(shí)期顯著影響[34-36]。我們的研究結(jié)果表明，多年連作大田土中棉花根際微生物群落結(jié)構(gòu)受棉花發(fā)育時(shí)期顯著影響。不同菌屬在棉花根際受到促進(jìn)或者抑制，其在根際與非根際土中的相對(duì)豐度差值大小隨發(fā)育時(shí)期的變化而不同。推測(cè)每個(gè)發(fā)育時(shí)期受到促進(jìn)或抑制作用較大的菌屬可能與這個(gè)時(shí)期特殊的棉花生長(zhǎng)發(fā)育生理特性有關(guān)。β-多樣性分析表明，隨著發(fā)育時(shí)期的變化，棉花對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響越來(lái)越大，并且棉花蕾期與花期根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異大于苗期與蕾期根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。我們推測(cè)棉花花期的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他2個(gè)時(shí)期相比差異較大，可能是該時(shí)期棉花根系對(duì)細(xì)菌的選擇作用降低造成的。

棉花連作是我國(guó)棉區(qū)的主要耕作方式。土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的多樣性降低程度是衡量連作障礙的重要指標(biāo)。土壤微生物在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抵御生物和非生物脅迫等過(guò)程中都有非常重要的作用。所以了解棉花在連作條件下的根際微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化可為將來(lái)人為干涉棉田微生物群落結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)，且對(duì)生物有機(jī)肥料的開(kāi)發(fā)和利用、減少化學(xué)農(nóng)藥和化肥的使用、保護(hù)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)有重要意義。

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