建立SCID鼠增生性瘢痕模型的實(shí)驗(yàn)研究

錢進(jìn)　鄧辰亮　楊松林　鄭江紅

增生性瘢痕（Hypertrophic scars，HS）是外傷、燒傷和手術(shù)后，皮膚損傷處經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的炎癥反應(yīng)及病理性纖維化過(guò)程而產(chǎn)生的，其組織學(xué)特點(diǎn)是大量炎性細(xì)胞及生長(zhǎng)因子浸潤(rùn)、新生血管大量形成、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度堆積，膠原沉積及形態(tài)重塑、肌成纖維細(xì)胞形成等[1-3]。HS表現(xiàn)為高出皮面、充血狀、質(zhì)地實(shí)韌的紅色或暗紅色皮損，伴有局部疼痛瘙癢，其特點(diǎn)是病變范圍不超過(guò)原損傷范圍。盡管增生性瘢痕屬于良性病變[1，3-4]，但由于影響美觀，關(guān)節(jié)部位的瘢痕還可影響關(guān)節(jié)活動(dòng)，而且容易復(fù)發(fā)，因此是臨床上亟待解決的一大難題[5]。

增生性瘢痕治療手段主要有壓迫療法、瘢痕內(nèi)藥物注射治療、激光治療、生物敷料輔助治療及手術(shù)治療等[6-8]。由于病因尚未明確，因此缺乏針對(duì)性的治療手段。由于種屬間的差異，實(shí)驗(yàn)研究中缺乏一種病理特征完全相同的動(dòng)物模型[9-10]。本實(shí)驗(yàn)嘗試在重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠（SCID鼠）背部移植人類刃厚皮片，建立SCID鼠增生性瘢痕模型，并驗(yàn)證該模型的可行性，以期進(jìn)一步揭示增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)制。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

4周齡SCID小鼠30只（上海市腫瘤研究所），雌性，體質(zhì)量 18～23 g，為 T、B 淋巴細(xì)胞缺陷（BABL/c同源近交的突變系）；人類移植皮膚來(lái)源于臨床腹壁整形術(shù)切除皮膚，術(shù)前征得患者知情同意。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人類刃厚皮片切取

將手術(shù)切除的人類皮膚組織，經(jīng)75%乙醇消毒后，用滾軸取皮刀取下刃厚皮片，厚度約0.3 mm，修剪成1.5 cm×1.0 cm的皮片，用生理鹽水紗布包裹，放入無(wú)菌標(biāo)本盒中，置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2刃厚皮片移植

小鼠隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組20只，對(duì)照組10只。腹腔麻醉，實(shí)驗(yàn)組小鼠背部剪去1.5 cm×1.0 cm的皮膚，注意保留皮下毛細(xì)血管網(wǎng)完整，移植人刃厚皮片，凡士林紗布覆蓋并以縫線固定，無(wú)菌紗布加壓包扎。對(duì)照組形成創(chuàng)面后直接覆蓋凡士林紗布，同樣方法固定包扎。術(shù)后，同樣條件下分籠飼養(yǎng)，10 d后拆線，暴露術(shù)區(qū)。

1.2.3觀察術(shù)區(qū)移植物大體變化

術(shù)后10 d觀察瘢痕顏色、質(zhì)地、面積等變化，并拍照記錄，隨機(jī)選擇5只每周測(cè)量大體瘢痕厚度。

1.2.4模型瘢痕組織學(xué)檢測(cè)

術(shù)后2周、4周時(shí)，取下類瘢痕組織標(biāo)本，10%福爾馬林液固定24 h，制成石蠟標(biāo)本，切片（5μm厚），分別進(jìn)行HE染色和Masson＇s染色，鏡下觀察①瘢痕組織形態(tài)特點(diǎn)②新生血管生成情況③膠原形態(tài)及排列情況。

1.2.5瘢痕模型4-羥脯胺酸含量測(cè)定

參照Tejiram等[11]的方法，在術(shù)后4周時(shí)分別取實(shí)驗(yàn)組（5只）、對(duì)照組（2只）的標(biāo)本組織，磨成勻漿，與4N鹽酸溶液混勻后100℃酸解18 h，緩沖液清洗后超速離心，冷卻過(guò)濾后制成樣液，然后用比色法測(cè)定樣液中的羥脯胺酸含量（μg/mg），標(biāo)準(zhǔn)曲線由波長(zhǎng)（558±2）nm處吸光值繪制而成。

1.2.6檢測(cè)瘢痕模型組織中細(xì)胞因子的表達(dá)

RT-PCR測(cè)定TGF-β1和CTGF的表達(dá)情況。參考Wang等[12]的方法，術(shù)后2周、4周時(shí)分別取實(shí)驗(yàn)組（5只）、對(duì)照組（2只）標(biāo)本，磨成勻漿，用 DNA酶降解1 h以去除DNA雜質(zhì)干擾，離心提取mRNA。引物序列：TGF-β1（正）5'-TGTTAAAACTGGCATCTGA-3'、（反）5'-GTCtCTTAGGAAGTAGGT-3'； CTGF（正）5'-GAGTGTGCACTGCCAAAGAT-3'、（反）5'-GGCAAGTGCATTGGTATTTG-3'。合成初級(jí)cDNA后按照如下條件循環(huán)擴(kuò)增：95℃下變性10 min，間隔15 s，擴(kuò)增40次，然后在60℃下退火引物鏈結(jié)合，間隔60 s。將PCR產(chǎn)物電泳30 min后觀察結(jié)果，表達(dá)水平記錄為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比值。

1.3　數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用單因素方差檢驗(yàn)，Excel統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　瘢痕模型形態(tài)學(xué)變化

術(shù)后10 d拆線后，實(shí)驗(yàn)組皮片顏色暗紅、質(zhì)地柔軟；術(shù)后2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組2只小鼠皮片顏色逐漸變?yōu)楹谏?，干燥，結(jié)痂脫落；其余小鼠皮片周圍逐漸隆起，有灰褐色邊界，整個(gè)皮片顏色逐漸變?yōu)榭Х壬?，表皮結(jié)痂，約30 d后痂皮逐漸脫落，瘢痕樣組織逐漸隆起，高出皮面，呈淡紅褐色，質(zhì)地偏硬，充血狀；術(shù)后8周時(shí)，瘢痕逐漸收縮，顏色呈深褐色。對(duì)照組小鼠皮膚自行愈合結(jié)痂，長(zhǎng)期存活，20 d后結(jié)痂脫落，皮膚與周圍皮膚無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)組大體組織厚度明顯增加，術(shù)后2周、4周時(shí)分別增加（20.2%±4.3%）、（25.1%±3.5%）；術(shù)后8周時(shí)有所下降，但仍較原組織增加了（22.6%±3.2%）（P＜0.05）（圖 1、圖 3A）。

2.2　瘢痕模型組織學(xué)變化

術(shù)后4周的標(biāo)本HE染色后，鏡下可見(jiàn)真皮層增厚，皮膚附屬器結(jié)構(gòu)改變，毛囊減少，部分層次不連續(xù)，新生血管形成，類瘢痕組織厚度較對(duì)照組明顯增加。Masson＇s染色結(jié)果顯示膠原排列紊亂，膠原束較細(xì)，呈結(jié)節(jié)狀或旋渦狀分布（圖2）。

2.3　瘢痕模型組織總羥脯胺酸含量上調(diào)

羥脯胺酸的含量能夠反映組織中膠原的含量。術(shù)后4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組平均羥脯胺酸含量（52±9）μg/mg，較對(duì)照組（37±7）μg/mg明顯增加（P＜0.05）（圖 3B）。

2.4　瘢痕模型中TGF-β1與CTGF表達(dá)上調(diào)

TGF-β1和CTGF在瘢痕形成過(guò)程中共同調(diào)節(jié)纖維化過(guò)程[13]。RT-PCR結(jié)果顯示，術(shù)后2周和4周時(shí)，TGF-β1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯提高（P＜0.01）；CTGF的變化和TGF-β1相似，實(shí)驗(yàn)組亦較對(duì)照組明顯提高（P＜0.01）（圖 3C、D）。

圖1　移植皮片后瘢痕模型大體觀察Fig.1　Gross observation of scar model after skin graft

圖2　移植皮片后瘢痕模型組織學(xué)觀察Fig.2　Histological observation of scar model after skin graft

圖3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Fig.3 Data statistics

3　討論

HS的主要病理特點(diǎn)為過(guò)度的炎癥反應(yīng)及病理性纖維化過(guò)程[2，14]。大量研究表明，過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)阻礙創(chuàng)面的正常愈合，并且炎癥細(xì)胞可導(dǎo)致正常纖維化過(guò)程紊亂，從而導(dǎo)致病理性纖維化。因此，在病程早期，HS組織學(xué)上表現(xiàn)為炎性細(xì)胞的大量浸潤(rùn)及新生血管形成，而隨著病程推移，則表現(xiàn)為纖維化過(guò)程的紊亂，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，尤其是Ⅰ型膠原的沉積[2，15]。但是，進(jìn)一步的研究受制于理想動(dòng)物模型的缺乏，許多動(dòng)物模型嘗試移植人類瘢痕，但由于只局限于終末期瘢痕的纖維化改變，而不包括對(duì)瘢痕形成初始影響因素的研究，因此這類模型存在很大的局限性[9]。

迄今為止，比較理想的動(dòng)物模型有以下幾種。Morris等[16]首先建立了兔耳瘢痕模型，該模型在兔耳表面制造深達(dá)軟骨膜毛細(xì)血管網(wǎng)的創(chuàng)面，通過(guò)軟骨表面愈合形成瘢痕組織，但兔耳皮膚層次中缺乏皮下組織層，與人類皮膚結(jié)構(gòu)存在明顯差異[17-18]。Zhu等[19]報(bào)道了紅色Duroc豬背部深層次創(chuàng)面通過(guò)瘢痕樣組織修復(fù)，盡管豬皮膚解剖結(jié)構(gòu)與人類最為相似，但所形成的類瘢痕組織在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為低平緊縮，而不是人HS那樣潮紅充血，高出皮面[20-22]。Yang等[23]建立了裸鼠表面移植人全厚皮片的瘢痕模型，形成的移植產(chǎn)物在形態(tài)學(xué)與組織學(xué)上與人HS相似。后續(xù)研究進(jìn)一步優(yōu)化了這個(gè)模型，通過(guò)在裸鼠表面移植人刃厚皮片，形成的瘢痕組織較之前的模型在組織學(xué)與形態(tài)學(xué)方面與人HS更為接近[24-25]。

SCID鼠由于其T、B細(xì)胞缺乏，而對(duì)外源性抗原無(wú)細(xì)胞免疫及抗體反應(yīng)，和裸鼠相似。這種免疫缺陷也使得皮膚移植排斥反應(yīng)減輕，從而使皮膚存活時(shí)間延長(zhǎng)，為后續(xù)瘢痕長(zhǎng)時(shí)間維持提供了理論支持[26]。我們將人刃厚皮片移植到SCID鼠背部，術(shù)后10 d拆線后，移植組織顏色粉紅、質(zhì)軟、邊緣輕度高出皮面，提示皮片存活良好。約1個(gè)月左右，移植物逐漸變硬、顏色加深，且表面干燥結(jié)痂。待痂皮逐漸脫落后，觀察到明顯高出皮面的紅褐色瘢痕樣組織，與人HS外觀相似。實(shí)驗(yàn)組20只小鼠中，18只可得到具有上述特點(diǎn)的類瘢痕組織，形成后均能存活2個(gè)月以上，且厚度逐漸增加，但持續(xù)一段時(shí)間后逐漸降低。另外兩只SCID鼠移植皮片顏色逐漸發(fā)黑，約術(shù)后20 d壞死脫落，術(shù)后1個(gè)月創(chuàng)面由鄰近自身皮膚修復(fù)。皮片壞死可能由于移植皮膚抗原性過(guò)強(qiáng)、小鼠個(gè)體免疫差異，以及手術(shù)包扎等原因引起。

人HS在組織學(xué)上表現(xiàn)為真皮層增厚，真皮乳頭層及網(wǎng)狀層界限不清，皮膚附屬器結(jié)構(gòu)改變，包括毛囊及釘突數(shù)量減少，毛細(xì)血管化明顯[25]。我們?cè)谀Ｐ椭锌梢杂^察到上述變化，并且組織學(xué)厚度的測(cè)量和大體結(jié)果一致，排除了小鼠自體愈合的干擾；值得一提的是，移植物的組織切片中可觀察到肌成纖維細(xì)胞，而該細(xì)胞是人HS形成過(guò)程中的關(guān)鍵因素之一[27]，該細(xì)胞的數(shù)量上升可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度合成，從而增加瘢痕厚度。

膠原過(guò)度沉積和膠原束排列紊亂是人HS的另一特點(diǎn)。由于炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞分泌的大量生長(zhǎng)因子，引起傷口愈合纖維化過(guò)程紊亂，導(dǎo)致膠原異常增生，特別是Ⅰ型膠原，在HS中膠原束往往較細(xì)長(zhǎng)，直徑在60 nm左右，而正常皮膚Ⅰ型膠原直徑100 nm，成粗大條索狀平行于皮面[25，28]。 Masson's染色后，觀察到移植物膠原束較細(xì)長(zhǎng)，成旋渦狀或結(jié)節(jié)狀分布，可提示該組織中膠原異常沉積且排列紊亂。羥脯胺酸含量測(cè)定表明組織中膠原含量增加[28-29]，進(jìn)一步說(shuō)明該模型與人HS在膠原分布上的相似性。

TGF-β是人創(chuàng)面愈合過(guò)程中的重要作用因子，參與炎癥反應(yīng)、血管再生、成纖維細(xì)胞增生、膠原及細(xì)胞外基質(zhì)的合成與重塑等過(guò)程[13，30]。在燒傷患者的血清中，往往可以觀察到TGF-β的過(guò)度表達(dá)。研究表明，HS與TGF-β1的作用關(guān)系密切，而CTGF作為TGF-β1表達(dá)通路下游調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)纖維化過(guò)程中和TGF-β1協(xié)同作用，TGF-β1和CTGF的表達(dá)水平可能對(duì)纖維化過(guò)程及瘢痕預(yù)后有潛在影響[13]。本實(shí)驗(yàn)中，移植物中的TGF-β1及CTGF的mRNA水平相較對(duì)照組有顯著升高，表明該模型中類瘢痕組織的產(chǎn)生可能是TGF-β1與CTGF協(xié)同作用的結(jié)果。Sisco等[31]的研究顯示，在動(dòng)物模型中抑制CTGF的表達(dá)能夠有效減少肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量、TIPM-1及Ⅰ型膠原的合成，從而抑制HS的形成，但不會(huì)延長(zhǎng)傷口愈合時(shí)間。我們擬在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步通過(guò)該模型來(lái)研究CTGF對(duì)于人HS的作用機(jī)制。

除了TGF-β外，該模型產(chǎn)生瘢痕的原因較復(fù)雜，考慮到該模型所用SCID鼠是一種免疫缺陷鼠，但其巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、NK細(xì)胞均正常，而巨噬細(xì)胞也是HS形成早期就存在并發(fā)揮功能的一種炎性細(xì)胞，并能夠分泌大量生長(zhǎng)因子，從而影響炎癥反應(yīng)及纖維化[32-34]，其中就包括TGF-β。因此，可以推測(cè)巨噬細(xì)胞的功能可能是該模型類瘢痕組織形成的另一因素，也可能是該模型的潛在應(yīng)用方向和治療靶點(diǎn)。

綜上所述，我們可通過(guò)移植人類刃厚皮片于SCID鼠背創(chuàng)面，獲得類似于人HS的組織，其在形態(tài)學(xué)及組織學(xué)上和人HS相似，但是尚不能證明兩者完全一致，還需要從細(xì)胞水平進(jìn)一步檢測(cè)巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的表達(dá)水平。但該模型制作操作簡(jiǎn)單，并能從瘢痕形成初始開(kāi)始觀察，具有很好的可控性，是一種理想的瘢痕模型。

[1]Momtazi M,Ding J,Kwanp,et al.Morphologic and histologic comparison of hypertrophic scar in nude mice,T-cell receptor,and recombination activating gene knockout mice[J].Plast Reconstr Surg,2015,136(6)：1192-1204.

[2]Ogawa R.Keloid and hypertrophic scars are the result of chronic inflammation in the reticular dermis[J].Int JMol Sci,2017,18(3)：E606.

[3]Ali S,Hajrah NH,Ayuob NN,et al.Morphological and morphometric study of cultured fibroblast from treated and untreated abnormal scar[J].Saudi Med J,2010,31(8)：874-881.

[4]Shekhter AB,Guller AE.The morphologic characteristics of scar tissues and the new clinicomorphologic classification of human skin scars[J].Arkh Patol,2008,70(1)：6-13.

[5]Mari W,Alsabri SG,Tabal N,et al.Novel insights on understanding of keloid scar：article review[J].JAm Coll Clin Wound Spec,2016,7(1-3)：1-7.

[6]Ledon JA,Savas J,Franca K,et al.Intralesional treatment for keloids and hypertrophic scars：a review[J].Dermatol Surg,2013,39(12)：1745-1757.

[7]Kadunc BV,Trindade de Almeida AR.Surgical treatment of facial acne scars based on morphologic classification：a Brazilian experience[J].Dermatol Surg,2003,29(12)：1200-1209.

[8]Rabello FB,Souza CD,Farina Júnior JA.Update on hypertrophic scar treatment[J].Clinics(Sao Paulo),2014,69(8)：565-573.

[9]Domergue S,Jorgensen C,No e l D.Advances in research in animal models of burn-related hypertrophic scarring[J].J Burn Care Res,2015,36(5)：e259-e266.

[10]Honardoust D,Kwan P,Momtazi M,et al.Novel methods for the investigation of human hypertrophic scarring and other dermal fibrosis[J].Methods Mol Biol,2013,1037：203-231.

[11]Tejiram S,Zhang J,Travis TE,et al.Compression therapy affects collagen type balance in hypertrophic scar[J].J Surg Res,2016,201(2)：299-305.

[12]Wang J,Ding J,Jiao H,et al.Human hypertrophic scar-like nude mousemodel：characterization of themolecular and cellular biology of thescar process[J].Wound Repair Regen,2011,19(2)：274-285.

[13]Penn JW,Grobbelaar AO,Rolfe KJ.The role of the TGF-βfamily in wound healing,burns and scarring：a review[J].Int J Burns Trauma,2012,2(1)：18-28.

[14]Berman B,Maderal A,Raphael B.Keloids and hypertrophic scars：pathophysiology,classification,and treatment[J].Dermatol Surg,2017,43 Suppl 1：S3-S18.

[15]Ogawa R,Akaishi S.Endothelial dysfunction may play a key role in keloid and hypertrophic scar pathogenesis-Keloids and hypertrophic scars may be vascular disorders[J].Med Hypotheses,2016,96：51-60.

[16]Morris DE,Wu L,Zhao LL,et al.Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring：quantitative studies[J].Plast Reconstr Surg,1997,100(3)：674-681.

[17]Nabai L,Ghahary A.Hypertrophic scarring in the rabbit ear：a practical model for studying dermal fibrosis[J].Methods Mol Biol,2017,1627(4)：81-89.

[18]Jia S,Xie P,Hong SJ,et al.Local application of statins significantly reduced hypertrophic scarring in a rabbit ear model[J].Plast Reconstr Surg Glob Open,2017,5(6)：e1294.

[19]Zhu KQ,Engrav LH,Gibran NS,et al.The female,red Duroc pig as an animal model of hypertrophic scarring and the potential role of the cones of skin[J].Burns,2003,29(7)：649-664.

[20]Foubert P,Zafra D,Liu M,et al.Autologous adipose-derived regenerative cell therapy modulates development of hypertrophic scarring in a red Duroc porcine model[J].Stem Cell Res Ther,2017,8(1)：261.

[21]Sood RF,Muffley LA,Seaton ME,et al.Dermal fibroblasts from the red Duroc pig have an inherently fibrogenic phenotype：an in vitro model of fibroproliferative scarring[J].Plast Reconstr Surg,2015,136(5)：990-1000.

[22]Harunari N,Zhu KQ,Armendariz RT,et al.Histology of the thick scar on the female,red Duroc pig：final similarities to human hypertrophic scar[J].Burns,2006,32(6)：669-677.

[23]Yang DY,Li SR,Wu JL,et al.Establishment of a hypertrophic scar model by transplanting full-thickness human skin grafts onto the backs of nude mice[J].Plast Reconstr Surg,2007,119(1)：104-109.

[24]Alrobaiea SM,Ding J,Ma Z,et al.A novel nude mouse model of hypertrophic scarring using scratched full thickness human skin grafts[J].Adv Wound Care(New Rochelle),2016,5(7)：299-313.

[25]Momtazi M,Kwan P,Ding J,et al.A nude mouse model of hypertrophic scar shows morphologic and histologic characteristics of human hypertrophic scar[J].Wound Repair Regen,2013,21(1)：77-87.

[26]de Vries TJ,Andreotta S,Loos BG,et al.Genes critical for developing periodontitis：lessons from mouse models[J].Front Immunol,2017,8：1395.

[27]Wang J,Jiao H,Stewart TL,et al.Accelerated wound healing in leukocyte-specific,protein 1-deficient mouse is associated with increased infiltration of leukocytes and fibrocytes[J].J Leukoc Biol,2007,82(6)：1554-1563.

[28]Berthod F,Germain L,Li H,et al.Collagen fibril network and elastic system remodeling in a reconstructed skin transplanted on nude mice[J].Matrix Biol,2001,20(7)：463-473.

[29]Marcos-Garcés V,Harvat M,Molina Aguilar P,et al.Comparative measurement of collagen bundle orientation by Fourier analysis and semiquantitative evaluation：reliability and agreement in Masson's trichrome,Picrosirius red and confocal microscopy techniques[J].JMicrosc,2017,267(2)：130-142.

[30]Guo J,Lin Q,Shao Y,et al.BMP?7 suppresses excessive scar formation by activating the BMP?7/Smad1/5/8 signaling pathway[J].Mol Med Rep,2017,16(2)：1957-1963.

[31]Sisco M,Kryger ZB,O'Shaughnessy KD,et al.Antisense inhibition of connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)mRNA limits hypertrophic scarring without affecting wound healing in vivo[J].Wound Repair Regen,2008,16(5)：661-673.

[32]Hesketh M,Sahin KB,West ZE,et al.Macrophage phenotypes regulate scar formation and chronic wound healing[J].Int J Mol Sci,2017,18(7)：E1545.

[33]He L,Marneros AG.Macrophages are essential for the early wound healing response and the formation of a fibrovascular scar[J].Am JPathol,2013,182(6)：2407-2417.

[34]Willenborg S,Eming SA.Macrophages-sensors and effectors coordinating skin damage and repair[J].J Dtsch Dermatol Ges,2014,12(3)：214-221.