StAR基因高表達(dá)對(duì)DEHP致MCF-7細(xì)胞凋亡作用的影響

彭 　鵬 王潮崗 徐新云 * 夏俊杰黃海燕王 　利黃奕欽楊 　晨

（1．深圳市疾病預(yù)防控制中心毒理研究所，廣東 　深 圳 　518055；2．深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東 　深 圳 　518060；3．南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 　衡 陽(yáng) 　421001）

鄰苯二甲酸酯類(phthalate acid esters，PAEs)化合物是常見(jiàn)的塑化劑，一般為無(wú)色油狀黏稠液體，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，常溫下不易揮發(fā)。我國(guó)常用PAEs的品種包括鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]、鄰苯二甲酸二辛酯(dioctyl phthalate，DOP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(diisooctyl phthalate，DIOP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)等30多種化合物。DEHP屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一，具有生殖毒性、胚胎發(fā)育毒性、遺傳毒性、免疫毒性[1-7]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)研究表明，DEHP主要通過(guò)雌激素樣作用、干擾內(nèi)分泌調(diào)節(jié)而作用于生殖系統(tǒng)。類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenio acute regulatory protein，StAR)是類固醇激素合成過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因素，StAR是一類膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可促進(jìn)類固醇激素合成細(xì)胞中膽固醇自線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)膜，進(jìn)而轉(zhuǎn)化合成類固醇激素，是該類激素合成的限速步驟[8-10]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，DEHP染毒后動(dòng)物睪丸和卵巢組織中StAR基因表達(dá)水平升高，StAR基因可能在DEHP致生殖毒性中發(fā)揮重要的作用[2-3]。為了深入研究DEHP的生殖內(nèi)分泌毒性機(jī)制，本文通過(guò)分子克隆技術(shù)，應(yīng)用慢病毒載體構(gòu)建StAR基因高表達(dá)的細(xì)胞，研究StAR基因高表達(dá)對(duì)DEHP致細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究DEHP的生殖毒性機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　主要試劑

限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I，T4 DNA連接酶，均購(gòu)于美國(guó)Fermentas公司；DNA膠回收試劑盒RNeasy Mini試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)，Prime Scrip RT reagent Kit和SYBR Primescript RT-PCR Kit(中國(guó) TAKARA公司)，質(zhì)粒小量提取和無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒(美國(guó)OMEGA Bio-tek公司)，J107大腸桿菌感受態(tài)(天根生物公司)，真核表達(dá)載體pLVX-mCUV-ZSgreen-PGLC-Puro(以下簡(jiǎn)稱pLVX載體，Biovector公司)，包裝輔助質(zhì)粒PLVX-GFP和該質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的慢病毒包裝試劑盒 (美 國(guó) Clontech公 司 )， 293FT細(xì) 胞 (美 國(guó) Invitrogen公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，人乳腺癌MCF-7細(xì)胞(中國(guó)上海細(xì)胞庫(kù))，StAR基因PCR引物由上海生工合成，兔抗StAR(ab133657)一抗為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP均為美國(guó)Thermo Scientific 公司產(chǎn)品。

1.2　StAR cDNA的擴(kuò)增及其克隆載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank的StAR基因序列對(duì)所需引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，序列如下：F，5′-GGAATTCCAGGAAACAATGCT GCTAG-3′(EcoR Ⅰ)；R，5′-CCCTCGAGCAGGCTGGT CTTCAACAC-3′(Xho I)。按照Premix PrimeSTARHS的使用說(shuō)明配置反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，退火溫度為72℃。PCR完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并再用ExTaq酶進(jìn)行加A尾反應(yīng)。按照pLVX載體的說(shuō)明書(shū)，將加A尾產(chǎn)物與pLVX載體連接，轉(zhuǎn)化J107感受態(tài)細(xì)菌。常規(guī)篩選鑒定，挑取小量培養(yǎng)的PCR鑒定陽(yáng)性克隆的細(xì)菌菌液，送至生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序確認(rèn)。

1.3　慢病毒載體構(gòu)建與包裝

挑取測(cè)序正確的重組T載體，先進(jìn)行Xho I酶切，用核酸共沉劑回收酶切產(chǎn)物后，再用EcoR I酶切。電泳鑒定后，用DNA膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，然后將其與經(jīng)過(guò)相同處理的pLVX-GFP載體連接，轉(zhuǎn)化J107感受態(tài)細(xì)菌。小量培養(yǎng)篩選出來(lái)的細(xì)菌，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并將菌液送至上海生工測(cè)序。挑取測(cè)序正確的重組pLVX-GFP載體，用pLVX-GFP載體對(duì)應(yīng)的慢病毒包裝試劑盒將pLVX-GFP載體和包裝載體共轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，置于37 ℃培養(yǎng)48 h后將上清培養(yǎng)基用0.45 μmol/L濾膜過(guò)濾，收集病毒上清，使用Lenti-X GoStix金標(biāo)試劑盒測(cè)定病毒滴度，然后保存于-80 ℃。

1.4　慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞

將3×105個(gè)MCF-7細(xì)胞接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)18 h后細(xì)胞匯合度達(dá)到50%，取病毒上清用RPMI-1640完全培養(yǎng)基按1∶1稀釋后，再加入Polybrene至終濃度為6～10 μg/mL。去除培養(yǎng)瓶中原有的完全培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍后加人上述含慢病毒的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h，去除含慢病毒的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，加入正常的RPMI-1640完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，然后換用1 μg/mL嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，每隔2 d換液1次，篩選時(shí)間為7 d。

1.5　StAR高表達(dá)細(xì)胞株的鑒定

1.5.1熒光定量PCR檢測(cè)StAR mRNA表達(dá)水平分別接種MCF-7細(xì)胞和上述1.4轉(zhuǎn)染StAR基因的MCF-7細(xì)胞(3×105個(gè))，培養(yǎng)細(xì)胞24 h后至細(xì)胞密度為80%。按照RNeasy Mini Kit說(shuō)明書(shū)，提取細(xì)胞總RNA；用Prime Scrip RT reagent Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別取兩種細(xì)胞的cDNA各1 μL為模板進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)StAR mRNA表達(dá)量的變化，確認(rèn)StAR高表達(dá)細(xì)胞株。

1.5.2Western blot檢測(cè)StAR蛋白表達(dá)水平 將正常MCF-7細(xì)胞、轉(zhuǎn)染StAR基因的MCF-7細(xì)胞分別接種到25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(1×106個(gè))。培養(yǎng)約24 h后待細(xì)胞匯合度達(dá)90%后去除培養(yǎng)基，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，100 ℃變性8 min；用二辛可寧酸法(bicinchoninic acid assay，BCA法)進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍走M(jìn)行10% SDS-PACE電泳分離，接著將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。根據(jù)Marker和分子量將膜上含β-actin(43 kD)，StAR蛋白(32 kD)的部分分別切下，加入相應(yīng)的一抗，冰上孵育過(guò)夜；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入Western blot化學(xué)發(fā)光試劑后用冷CCD成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行曝光拍照，所得圖像用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度定量分析。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6　DEHP處理細(xì)胞

將正常MCF-7細(xì)胞和StAR基因高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞分別接種到6孔板上，待細(xì)胞融合度達(dá)80%進(jìn)行DEHP染毒，DEHP染毒濃度分別為0(溶劑對(duì)照)、0.05、0.10、0.20、0.40和0.80 mmol/L，染毒24 h，將6孔板中的染毒液去除干凈，用PBS清洗細(xì)胞兩次，提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR。

1.7　熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

按1.6的方法用DEHP染毒MCF-7細(xì)胞后，分別提取各個(gè)劑量組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT反應(yīng)體系是：5×Prime Script緩沖液4 μL，Prime Script RT酶 Mix I 1.0 μL， Oligo dT引 物 (50 μmol/L)1.0 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)1.0 μL，總RNA 1 μg，加RNase Freed H2O至20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、10 min，-20 ℃冰箱保存反轉(zhuǎn)錄樣品。目的基因Bax，Caspase-3，Caspase-8的熒光PCR引物委托上海生工公司合成，引物序列如下：Bax，正向5′-GCCAGCAAACTGGTGCTCAA-3′，反向5′-ATGTCCAGCCCATGATGGTTC-3′； Caspase-3， 正向 5′-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3′， 反 向5′-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3′； Caspase-8，正向5′-CAAATGCAAACTGGATGATGAC-3′，反向5′-AGCAGGCTCTTGTTGATTTGG-3′；GAPDH，正向5′-TCCTGCACCACCAACTGCTT-3′，反向5′-GTCTTCTGG GTGGCAGTGAT-3′。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH的CT值 為內(nèi)參，目的基因CT值 采用2-ΔΔCT法計(jì)算后的比值即為各基因的相對(duì)表達(dá)量，此步驟由ABI 7900HT分析軟件自動(dòng)計(jì)算并直接給出結(jié)果。

1.8　Western blot檢測(cè)StAR蛋白和凋亡蛋白的表達(dá)

DEHP染毒MCF-7細(xì)胞后，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白；用二辛可寧酸法(BCA法)進(jìn)行蛋白定量。配制10%分離膠，5%濃縮膠，依次加入蛋白樣品；濃縮膠于80 V條件下電泳30 min，分離膠于120 V條件下電泳50 min。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)束后，按0.8 mA/cm2膠面積設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流，恒流轉(zhuǎn)膜100 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。將PVDF膜放在一抗(抗StAR、Bax、Caspase-3、Caspase-8)(1∶300)稀釋液中4 ℃環(huán)境中過(guò)夜孵育，然后用TBST溶液洗3次，每次10 min。按1∶2 000比例稀釋HPR標(biāo)記的羊抗鼠二抗、HPR標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光試劑，在冷CCD成像系統(tǒng)里觀察結(jié)果。

1.9　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，StAR基因高表達(dá)組與對(duì)照組、DEHP實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以x±s表示，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1　StAR慢病毒載體測(cè)序鑒定結(jié)果

StAR基因高表達(dá)慢病毒載體的測(cè)序結(jié)果表明，外源基因插入位點(diǎn)正確，并且插入序列與GenBank上提供的信息完全相符，部分測(cè)序結(jié)果如圖1所示。

2.2　StAR慢病毒重組載體構(gòu)建與病毒包裝鑒定

應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分析StAR基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，可見(jiàn)明顯條帶，大小約1 000 bp，與預(yù)期相符。將含PCR產(chǎn)物的重組pLVX載體經(jīng)上海生工測(cè)序，與GenBank上該基因的序列完全相符。

圖1　StAR慢病毒載體測(cè)序鑒定結(jié)果

圖2　PCR擴(kuò)增StAR基因電泳結(jié)果

2.3　熒光定量PCR檢測(cè)StAR基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中StAR mRNA相對(duì)表達(dá)水平

將正常MCF-7細(xì)胞的StAR基因表達(dá)量作為對(duì)照，數(shù)值設(shè)為1，StAR基因轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的StAR mRNA表達(dá)量比正常MCF-7細(xì)胞提高591.9倍(p＜0.01)。

2.4　Western blot檢測(cè)StAR基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中StAR蛋白相對(duì)表達(dá)水平

以β-actin蛋白為內(nèi)參，檢測(cè)MCF-7細(xì)胞和StAR基因轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞StAR蛋白表達(dá)水平，經(jīng)歸一化處理后的灰度分析結(jié)果顯示，StAR基因轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞中StAR蛋白含量比MCF-7細(xì)胞升高190%(p＜0.01)。

圖3　Western blot檢測(cè)StAR蛋白表達(dá)水平

2.5　DEHP對(duì)StAR基因高表達(dá)細(xì)胞中凋亡基因mRNA表達(dá)水平的影響

0.10～0.8 mmol/L DEHP染毒MCF-7細(xì)胞后，Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組(0 mmol/L DEHP)顯著升高；0.05～0.8 mmol/L DEHP染毒時(shí)Caspase-8 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高；不同濃度DEHP染毒StAR高表達(dá)細(xì)胞后，Bax和Caspase-8 mRNA表達(dá)水平在染毒濃度為0.05～0.8 mmol/L時(shí)顯著升高，Caspase-3 mRNA在染毒濃度為0.1～0.8 mmol/L時(shí)表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)，見(jiàn)圖4。

2.6　DEHP對(duì)StAR基因高表達(dá)細(xì)胞中凋亡基因蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié) 果 顯 示 ， DEHP染 毒 MCF-7細(xì) 胞后，0.2～0.8 mmol/L DEHP染毒組Bax蛋白質(zhì)較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；0.1～0.8 mmol/L DEHP染毒組Caspase-3蛋白較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)；0.2～0.8 mmol/L DEHP染毒組Caspase-8蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。在DEHP 0.2 mmol/L劑量下，與同染毒劑量組的MCF-7細(xì)胞比較，StAR高表達(dá)細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平下降(p＜0.01)；DEHP其他劑量下，StAR高表達(dá)細(xì)胞Bax、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)與同染毒劑量組的MCF-7細(xì)胞比較均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖5～7。

3　討論

圖4　不同劑量DEHP染毒對(duì)MCF-7細(xì)胞和StAR基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

圖5　DEHP染毒對(duì)MCF-7細(xì)胞和StAR基因高表達(dá)細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)水平的影響

圖6　DEHP染毒對(duì)MCF-7細(xì)胞和StAR基因高表達(dá)細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

圖7　DEHP染毒對(duì)MCF-7細(xì)胞和StAR基因高表達(dá)細(xì)胞Caspase-8蛋白表達(dá)水平的影響

近年來(lái)DEHP的生殖毒性已有明確結(jié)論[1-7]，但是還存在很多沒(méi)有解決的問(wèn)題，比如DEHP究竟會(huì)引起哪些具體的基因及蛋白質(zhì)的改變、DEHP是通過(guò)何種信號(hào)通路來(lái)啟動(dòng)它的損傷機(jī)制的，在損傷過(guò)程中會(huì)引起哪些激素水平的改變等。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國(guó)際上對(duì)于生殖有關(guān)的基因調(diào)控進(jìn)行了許多研究，例如類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白StAR基因與雄性激素合成調(diào)控密切相關(guān)，StAR基因位于8號(hào)染色體上，其編碼的蛋白產(chǎn)物是StAR蛋白，StAR基因?qū)ΣG酮的生物合成具有重要的意義，對(duì)整個(gè)雄激素合成過(guò)程至為關(guān)鍵[9，11]。StAR蛋白位于線粒體內(nèi)，在線粒體外膜發(fā)揮作用。StAR基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，包括多種激素和信號(hào)途徑協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄機(jī)制合作與互動(dòng)，以及若干支配轉(zhuǎn)錄后的mRNA和蛋白表達(dá)機(jī)制[12]。研究表明StAR基因的表達(dá)紊亂會(huì)引起多囊卵巢綜合征等在內(nèi)的多種內(nèi)分泌紊亂型疾病的發(fā)生發(fā)展。StAR基因是類固醇激素合成過(guò)程中的限速酶也是關(guān)鍵酶，其表達(dá)可受到機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)的影響。所以本課題主要研究DEHP對(duì)乳腺癌細(xì)胞中StAR基因表達(dá)的影響。

Bax基因是Bcl-2基因家族中的一員，其表達(dá)產(chǎn)物可形成異源二聚體，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡加速發(fā)生。在正常細(xì)胞中Bax蛋白通常存在于細(xì)胞質(zhì)中，受到一系列死亡信號(hào)的刺激后會(huì)轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)，一旦到達(dá)線粒體的外膜，就會(huì)導(dǎo)致線粒體功能異常并引發(fā)凋亡。Caspase-3是凋亡中發(fā)揮起始和執(zhí)行作用的蛋白，也是最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是凋亡的主要效應(yīng)因子，其活化意味著凋亡浸入不可逆階段，Caspase-8則是凋亡的啟動(dòng)因子，在自我活化后能激活凋亡執(zhí)行，因此3種凋亡基因表達(dá)水平的變化表明，DEHP染毒對(duì)StAR基因高表達(dá)細(xì)胞的凋亡基因有顯著影響，并且與正常MCF-7細(xì)胞相比，DEHP對(duì)StAR基因高表達(dá)細(xì)胞的凋亡基因表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用。本文結(jié)果顯示，StAR基因高表達(dá)細(xì)胞中凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)水平隨DEHP濃度增加而增加。當(dāng)DEHP染毒劑量在中劑量和高劑量時(shí)，StAR基因高表達(dá)細(xì)胞和正常MCF-7細(xì)胞凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-8的mRNA表達(dá)水平均顯著高于未染毒的對(duì)照組，且StAR基因高表達(dá)細(xì)胞明顯高于正常MCF-7細(xì)胞。該結(jié)果提示StAR基因促進(jìn)了凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，推測(cè)其原因可能是DEHP染毒后在StAR基因高表達(dá)細(xì)胞中具有促進(jìn)凋亡基因活化的作用。

DEHP與我們生活環(huán)境密切相關(guān)，DEHP是當(dāng)今社會(huì)非常關(guān)注的環(huán)境污染物之一，幾乎存在于生活中的各個(gè)領(lǐng)域，包括塑料制品、食品包裝袋、兒童玩具、血袋，透析袋以及醫(yī)用導(dǎo)管中，其作用是增加塑料的可塑性和柔韌性，提高塑料強(qiáng)度，其含量可高達(dá)終產(chǎn)品的50%[13-14]。本文結(jié)果表明，DEHP具有顯著促進(jìn)凋亡基因表達(dá)的生物學(xué)作用，而且StAR基因高表達(dá)細(xì)胞比正常MCF-7細(xì)胞的凋亡基因表達(dá)水平更高，提示StAR基因高表達(dá)具有促進(jìn)DEHP的致凋亡作用，為深入研究DEHP的生殖毒性提供了科學(xué)依據(jù)。

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