甜菜堿改善水稻高GC含量DNA序列的PCR擴增

王同同 張利平 尹康權(quán)

（1. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071002；2. 中國科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國家重點實驗室，北京 100101）

水稻是人類最主要的糧食作物之一。隨著地球人口日益增長，人們對于糧食需求也日益增高，因此研究水稻增產(chǎn)、抗病、抗旱等各個領(lǐng)域均具有重要意義。自1988年以來，科學(xué)家發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)［1］，之后被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。對水稻DNA序列的PCR擴增是水稻各個研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)技術(shù)。然而相比擬南芥等雙子葉模式植物，水稻基因組有更多的高GC含量DNA序列。高GC 含量DNA序列容易形成二級結(jié)構(gòu)，使得DNA模板變性會很困難，同時退火時引物與模板結(jié)合受阻，不容易配對或容易形成錯配從而導(dǎo)致擴增效率很低或者擴增失?。?］，這使得許多的水稻DNA序列用常規(guī)的PCR方法難以擴增。已知使用Two-Step PCR［3-4］和Slow-Down PCR［5-6］可以促進(jìn)高GC含量DNA序列的擴增，但是在我們以往實驗中發(fā)現(xiàn)這兩種方法對于許多水稻的高GC含量DNA序列擴增并無明顯作用。已有文獻(xiàn)報道甘油、二甲基亞砜、甲酰胺、核苷酸類似物7-deaza dGTP、dITP、牛血清白蛋白（BSA）、Triton X-100、乙二醇和1，2-丙二醇等添加劑可促進(jìn)高GC含量DNA序列的PCR擴增［7-16］。這些添加劑不僅可以阻止模板和引物的二級結(jié)構(gòu)的形成，還可以提高引物在溫度低于其熔解溫度的情況下與模板鏈的退火機會［17-19］。我們在研究中發(fā)現(xiàn)擴增高GC含量水稻DNA序列時在PCR反應(yīng)體系中加入甜菜堿（Betaine）能夠明顯提高PCR產(chǎn)物擴增的特異性和產(chǎn)率。通過對3個高GC含量的水稻基因片段LOC_Os08g06050（GC 含量 75.4%）、LOC_Os01g01019（GC含量64.2%）和LOC_Os01g11080（GC含量73.9%）進(jìn)行PCR擴增，在反應(yīng)體系中加入不同濃度的甜菜堿，發(fā)現(xiàn)甜菜堿濃度在1-2 mol/L時能夠明顯改進(jìn)PCR擴增效果。同時，用二甲基亞砜和甘油作為PCR添加劑同樣地擴增這3個高GC含量水稻基因片段，發(fā)現(xiàn)二者雖然也可以表現(xiàn)出促進(jìn)效果，但都不如甜菜堿明顯。此外，還使用了不同的DNA聚合酶對LOC_Os01g01019基因片段進(jìn)行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)加入甜菜堿都能增強特異性，并且提高PCR產(chǎn)物的收率。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中水稻品種為日本晴野生型水稻；Fastpfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公司；Phusion超保真 DNA聚合酶和Q5 高保真DNA聚合酶購自New England Biolabs（NEB）公司；甜菜堿（Betaine）、二甲基亞砜（DMSO）和甘油（Glycerin）試劑均購自Sigma-Aldrich公司；快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻DNA提取 利用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒來提取水稻葉片基因組DNA作為PCR模板。利用NanoDrop 2000分光光度計測定DNA濃度。

1.2.2 引物 本實驗挑選了3個高GC含量的水稻基因片段：LOC_Os08g06050（部分序列，片段大小為399 bp，GC含量75.4%）、LOC_Os01g01019（部分序列，片段大小為1 016 bp，GC含量64.2%）和LOC_Os01g11080（部分序列，片段大小為1 034 bp，GC含量 73.9%），并設(shè)計引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

水稻基因片段LOC_Os08g06050引物序列為：

正向引物AGCGGAAACCTGGGCGAGTTGTC，反向引物CCGACGAGACGTCGTCGCGC；

水稻基因片段LOC_Os01g01019引物序列為：

正向引物AGGACGTTGACAGGTGCTGGAG，反向引物ACTGCTCAACCGCATGCCCATG；

水稻基因片段LOC_Os01g11080引物序列為：

正向引物ATGGGCCACGCATCCACCGACC，反向引物TCTCCGGCGAGCTCACTCACCAC。

1.2.3 PCR擴增體系及條件 Taq DNA聚合酶反應(yīng)體系（50 μL）包括 5 μL 10×Taq 緩沖液（Mg2+free），4 μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture，4 μL 50 mmol/L MgCl2，10 μmol/L 正向引物與反向引物各 1 μL，100 ng 水稻基因組DNA，2.5 U Taq DNA 聚合酶，反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的甜菜堿（反應(yīng)終濃度為0-2.75 mol/L），二甲基亞砜（反應(yīng)終濃度為0-20%）或者甘油（反應(yīng)終濃度為0-20%）。3個基因的PCR反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸70 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。

Phusion 超保真DNA聚合酶反應(yīng)體系（50 μL）包括 10 μL 5×Phusion HF 緩沖液，4 μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture，2 μL 50 mmol/L MgCl2，10 μmol/L正向引物與反向引物各1 μL，100 ng 水稻基因組DNA，2.5 U Phusion超保真DNA聚合酶，向反應(yīng)體系中加入終濃度為1.5 mol/L的甜菜堿。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性20 s，65℃退火20 s，72℃延伸35 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。

Q5高保真DNA聚合酶反應(yīng)體系（50 μL）包括 10 μL 5×Q5 反應(yīng)緩沖液，4 μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture，2 μL 50 mmol/L MgCl2，10 μmol/L 正向引物與反向引物各1 μL，100 ng 水稻基因組DNA，2.5 U Q5高保真DNA聚合酶，向反應(yīng)體系中加入終濃度為1.5 mol/L的甜菜堿。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，65℃退火30 s，72℃延伸35 s，30個循環(huán)；72℃延伸2 min。

Fastpfu DNA聚合酶反應(yīng)體系（50 μL）包括10 μL 5×Fastpfu 緩 沖 液，4 μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture，2 μL 50 mmol/L MgCl2，10 μmol/L 正向引物與反向引物各1 μL，100 ng 水稻基因組DNA，2.5 U Fastpfu DNA聚合酶，向反應(yīng)體系中加入終濃度為1.5 mol/L的甜菜堿。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸35 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。

以上PCR反應(yīng)均進(jìn)行兩次重復(fù)實驗。

1.2.4 PCR產(chǎn)物條帶分析 取PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳后用JY04S-3C型凝膠成像分析系統(tǒng)（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）進(jìn)行掃描成像，并用ImageJ軟件分析PCR產(chǎn)物條帶灰度值，通過Excel軟件統(tǒng)計匯總并做圖表分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度甜菜堿下水稻高GC含量DNA片段的PCR擴增

以水稻DNA為模板，用Taq DNA聚合酶對3個高GC含量的水稻基因片段LOC_Os08g06050（GC含 量 75.4%）、LOC_Os01g01019（GC含 量 64.2%）和LOC_Os01g11080（GC含量73.9%）進(jìn)行PCR擴增，在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為0、0.25 mol/L、0.5 mol/L、0.75 mol/L、1.0 mol/L、1.25 mol/L、1.5 mol/L、1.75 mol/L、2.0 mol/L、2.25 mol/L、2.5 mol/L和2.75 mol/L的甜菜堿。在擴增LOC_Os01g11080基因片段時，甜菜堿濃度在1-2.25 mol/L時對于PCR擴增具有明顯的增強效果；在擴增LOC_Os01g01019基因片段時，甜菜堿濃度在0.75-2 mol/L時對于PCR擴增具有明顯的增強效果；在擴增LOC_Os08g06050基因片段時，甜菜堿濃度在0.75-2 mol/L時對于PCR擴增具有明顯的增強效果（圖1）。分析本實驗中3個高GC含量的水稻基因片段的擴增情況，發(fā)現(xiàn)甜菜堿濃度在1-2 mol/L時能夠明顯提高擴增產(chǎn)量和產(chǎn)物特異性。

2.2 不同增強劑對于水稻高GC含量DNA片段PCR的影響

在利用Taq DNA聚合酶對3個高GC含量的水稻基因片段LOC_Os08g06050（GC含量75.4%）、LOC_Os01g01019（GC含 量64.2%） 和LOC_Os01g11080（GC含量73.9%）進(jìn)行PCR擴增時，分別添加了濃度梯度為0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%及20%的甘油和濃度梯度為0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%及20%的二甲基亞砜。在擴增LOC_Os01g11080基因片段時，7.5%-15%的甘油以及7.5%-12.5%的二甲基亞砜表現(xiàn)出明顯的增強效果；在擴增LOC_Os01g01019基因片段時，7.5%-10%的甘油以及5%-10%的二甲基亞砜表現(xiàn)出明顯的增強效果；在擴增LOC_Os08g06050基因片段時，7.5%-10%的甘油以及5%-10%的二甲基亞砜表現(xiàn)出明顯的增強效果（圖2）。

綜合分析圖2中3個基因片段的擴增結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜濃度在7.5%-10%時，甘油濃度在7.5%-10%時表現(xiàn)出了最明顯的增強效果。為了比較不同增強劑對PCR反應(yīng)的增強效果，選擇了10%的甘油和10%的二甲基亞砜與甜菜堿進(jìn)行平行比較。在利用Taq DNA聚合酶對3個高GC含量的水稻基因片段LOC_Os08g06050、LOC_Os01g01019和LOC_Os01g11080進(jìn)行PCR擴增時，分別添加了終濃度為10%二甲基亞砜、終濃度為10%的甘油以及終濃度為1.5 mol/L的甜菜堿。實驗結(jié)果（圖3）顯示雖然二甲基亞砜和甘油能夠促進(jìn)水稻高GC含量片段的擴增，但是促進(jìn)效果都沒有甜菜堿明顯。

2.3 甜菜堿對不同DNA聚合酶PCR的影響

為了驗證甜菜堿是否對于不同的DNA聚合酶催化的水稻高GC含量DNA序列的PCR反應(yīng)均有增強作用，分別用Taq DNA聚合酶、Phusion 超保真DNA聚合酶、Q5 高保真DNA聚合酶以及Fastpfu DNA聚合酶對LOC_Os01g01019基因片段進(jìn)行PCR擴增，并向各個反應(yīng)體系中加入終濃度均為1.5 mol/L的甜菜堿。結(jié)果（圖4）表明，對于這幾種DNA聚合酶，甜菜堿都起到了不同程度促進(jìn)效果，不僅提高了PCR產(chǎn)量，而且增強了產(chǎn)物特異性。

圖1 不同甜菜堿濃度對水稻高GC含量DNA片段PCR的影響

3 討論

水稻的基因組序列富含高GC含量的序列。高GC 含量DNA序列形成的二級結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，使得DNA模板變性會很困難，同時在退火時引物與模板結(jié)合受阻，容易形成錯配從而導(dǎo)致擴增效率很低或者擴增失?。?］。而且在PCR擴增的第一個循環(huán)時，高GC含量的模板DNA序列中的單股DNA容易形成分子內(nèi)部的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶擴增時可能會跳過莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致PCR產(chǎn)物缺少這段結(jié)構(gòu)的序列［20］，因此用傳統(tǒng)的PCR方法來準(zhǔn)確擴增水稻的高GC含量DNA序列非常困難。

在PCR反應(yīng)體系中加入甜菜堿能夠削弱二級結(jié)構(gòu)的影響，促進(jìn)PCR反應(yīng)的進(jìn)行［9-10，21］。但是其對PCR的作用又具有雙刃劍的特點，如圖1所示，加入甜菜堿的濃度過低時，不足以起到削弱二級結(jié)構(gòu)的作用；而過高的甜菜堿濃度會抑制PCR反應(yīng)，同樣使得擴增失敗。分析本實驗中3個高GC含量的水稻基因片段的擴增情況，發(fā)現(xiàn)甜菜堿濃度在1-2 mol/L時能夠明顯提高擴增產(chǎn)量和產(chǎn)物特異性。但是對于不同的GC含量的DNA序列，在PCR擴增時所需的最適甜菜堿濃度也會有所差異，因此對于所有的高GC含量水稻基因序列的PCR擴增，本實驗未能得出一個最適的甜菜堿濃度。

圖2 不同濃度的甘油和二甲基亞砜對水稻高GC含量DNA片段PCR的影響

圖3 不同增強劑對于水稻高GC含量DNA片段PCR的影響

此外，除了甜菜堿還有如二甲基亞砜、甘油等多種PCR增強劑都可以削弱高GC含量DNA序列二級結(jié)構(gòu)的影響。通過比較10%二甲基亞砜、10%甘油和終濃度1.5 mol/L的甜菜堿發(fā)現(xiàn)對于水稻的高GC含量DNA序列的PCR擴增，甜菜堿的增強效果最為明顯。有研究表明，將不同的PCR增強劑相互混合也可以有效地增強高GC含量基因序列的PCR擴增效果［22-24］，但其對于水稻高GC含量DNA序列的PCR擴增是否具有增強作用還需要進(jìn)一步深入研究。此外，甜菜堿對于長片段的PCR擴增也有增強作用，它能減少甚至消除長片段PCR擴增中的非特異擴增，對于這一點，二甲基亞砜和甘油等其他添加物則無明顯作用［25-27］。因此，如果遇到長片段的水稻高GC含量序列，甜菜堿將表現(xiàn)出更為明顯的增強優(yōu)勢。

目前，市面上的DNA聚合酶種類比較豐富，不同的DNA聚合酶對于水稻高GC含量DNA序列的擴增結(jié)果也不相同。在不加入甜菜堿時，Taq DNA聚合酶和Phusion超保真DNA聚合酶均對LOC_Os01g01019基因片段擴增失敗，Q5高保真DNA聚合酶和Fastpfu DNA聚合酶雖然能在一定程度上擴增得到目的片段，可是擴增特異性明顯降低。加入甜菜堿之后，對于4種DNA聚合酶，PCR擴增產(chǎn)量以及擴增特異性均明顯增強。這表明甜菜堿對于多種DNA聚合酶作用下的水稻高GC含量序列的PCR擴增均有增強作用。

圖4 甜菜堿對不同DNA聚合酶PCR的影響

4 結(jié)論

對于水稻高GC含量DNA序列的PCR擴增，加入終濃度為1-2 mol/L的甜菜堿能夠起到顯著的增強作用。這種增強作用明顯高于二甲基亞砜和甘油，并且對于多種DNA聚合酶作用下的水稻高GC含量序列的PCR擴增均有增強作用。

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