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    葡萄籽中白藜蘆醇的提取及其對(duì)LO2細(xì)胞氧化損傷保護(hù)及延緩衰老作用

    2018-04-08 02:48:30高原王福玲徐蓓蕾雒江菡閻力君趙瑩瑩王越
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年3期
    關(guān)鍵詞:雙水葡萄籽白藜蘆醇

    高原 王福玲 徐蓓蕾 雒江菡 閻力君 趙瑩瑩 王越

    (哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所,哈爾濱 150076)

    葡萄酒在生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生各種各樣的副產(chǎn)物,如葡萄籽、葡萄皮等,葡萄籽在葡萄皮渣這些副產(chǎn)物中高達(dá)到65%左右。葡萄籽中含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分,還富含白藜蘆醇[1]。白藜蘆醇是一類多酚類化合物,具有廣泛的抗癌、抗氧化、抗炎等作用。在清除自由基、保持機(jī)體自由基動(dòng)態(tài)平衡,延緩衰老方面也發(fā)揮著重要作用[2-3]。酒精是葡萄酒中的主要成分之一,急性酒精攝入對(duì)肝臟具有顯著的脂質(zhì)過氧化作用。目前,酒精對(duì)肝臟的影響及酒精性肝病發(fā)病機(jī)制的研究多集中于短期、急性酒精攝入方面,而有關(guān)白藜蘆醇與酒精對(duì)LO2肝細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建及氧化損傷保護(hù)作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過酒精誘導(dǎo)構(gòu)建LO2細(xì)胞的氧化損傷模型,并通過D-半乳糖構(gòu)建衰老小鼠模型,采用白藜蘆醇提取物干預(yù)后,對(duì)細(xì)胞及小鼠肝勻漿超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-px)、丙二醛(MDA)含量進(jìn)行測(cè)定,探討白藜蘆醇提取物對(duì)肝細(xì)胞損傷及延緩衰老的作用,旨為其抗氧化損傷機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞株 LO2細(xì)胞,哈爾濱商業(yè)大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所保存。

    1.1.2 動(dòng)物 昆明種健康小鼠,購自長春億斯。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 葡萄籽(購自哈爾濱家樂福超市);白藜蘆醇(≥98%,西安玉泉生物科技有限公司);四甲基氮唑鹽(Sigma公司);RPMI1640 培養(yǎng)基(四季青);雙抗(碧云天);胎牛血清(Hyclone);MDA、SOD 和GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

    1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 SX-700型高壓滅菌鍋(TOMY);高 效 液 相 色 譜 儀 Agilent1200(Agilent); 質(zhì)譜 儀 API3000(Applied Biosystems); 酶 標(biāo) 儀ELx800(BioTek),CO2培 養(yǎng) 箱(memmert); 生物安全柜(Airstream)紫外分光光度計(jì)(HALO DynamicaDB-20),電熱恒溫水浴鍋(上海華運(yùn)分析儀器有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 葡萄籽中白藜蘆醇的提取及檢測(cè) 將葡萄籽經(jīng)過粉碎機(jī)粉碎,過80目篩之后,準(zhǔn)確稱取粉碎后的葡萄籽樣品。分別通過乙醇浸提法、熱回流提取、超聲波輔助提取、超聲波輔助雙水相提取等方法對(duì)葡萄籽中的白藜蘆醇進(jìn)行提取。超聲波輔助雙水相提取是在葡萄籽樣品中加入一定量的乙醇-硫酸銨雙水相體系溶劑放入恒溫水浴鍋內(nèi)浸提,取出后用超聲提取。提取完畢后料液經(jīng)抽濾后,得到上下相,上相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,得葡萄籽粗提物。將粗提物用乙醇溶解,備用[4-7]。每種方法均取10.00 g葡萄籽粉末于三角瓶中,液料比為1∶10、浸提時(shí)間40 min、超聲功率300 W、超聲溫度50℃、超聲時(shí)間10 min,雙水相體系為(乙醇:硫酸銨=1∶1),處理后抽濾獲取上清液濃縮后乙醇溶解。

    HPLC檢測(cè)條件及定量方法如下:安捷倫1200高效液相色譜儀;HIQ Sil C18W(250 mm × 4.6 mm,5 μm)色譜柱;檢測(cè)波長為291 nm;檢測(cè)溫度為35℃;流動(dòng)相為乙腈-水(26∶74);流速為1 mL/min。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量[8]。通過檢測(cè)白藜蘆醇的含量計(jì)算白藜蘆醇提取率計(jì)算公式如下:

    式中:m為葡萄籽粗粉質(zhì)量(g);C為葡萄籽樣品溶液濃度(μg/mL);V為提取后濾液體積(mL);n為濾液中白藜蘆醇的含量。

    1.2.2 LO2細(xì)胞的培養(yǎng)與藥效學(xué)檢測(cè) 細(xì)胞株培養(yǎng)于含10% 胎牛血清與1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁長滿后,用0. 25%胰蛋白酶消化,傳代培養(yǎng)。按如下方法進(jìn)行MTT法細(xì)胞抑制率檢測(cè),取處于對(duì)數(shù)生長期的LO2細(xì)胞,使用含有10%胎牛血清與1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成1×104個(gè)細(xì)胞/mL;將200 μL細(xì)胞懸液分別加入96孔板每個(gè)孔中,置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔中加入不同濃度的白藜蘆醇提取物,稀釋至需要的工作濃度(0、5、10、20、40、80 μg/mL)。置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。首先加入80 μLDMSO,MTT用無血清RPMI1640培養(yǎng)液配成濃度為5 mg/mL的溶液,每孔中加入20 μL,置于37℃、5% CO2孵化培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸出上清,加入150 μL DMSO 溶解沉淀物,低速搖床震蕩10 min,OD480nm酶標(biāo)儀檢測(cè)。藥物對(duì)LO2細(xì)胞的存活率公式:

    細(xì)胞生長存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)× 100%

    1.2.3 白藜蘆醇提取物對(duì)酒精誘導(dǎo)LO2細(xì)胞抗氧化酶活力等指標(biāo)的影響 取處于對(duì)數(shù)生長期的LO2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,每孔1×104細(xì)胞,培養(yǎng)約12 h后,分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和不同濃度的白藜蘆醇組。陰性對(duì)照組不加受試物;陽性對(duì)照組只加入100 mmol/L酒精干預(yù)6 h,白藜蘆醇組(0、5、10、20、40 μg/mL)預(yù)處理12 h,各濃度再加入100 mmol/L酒精作用6 h,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。干預(yù)結(jié)束后用0.01 mol/L PBS清洗2次,然后每孔加入細(xì)胞裂解液100 μL裂解細(xì)胞后于4℃12 000 r/min 離心15 min取得上清,參照試劑盒要求,測(cè)定細(xì)胞中MDA水平、SOD活性、GSH-PX活性等相關(guān)氧化損傷的指標(biāo)[9]。陽性對(duì)照藥選取維生素C(0-40 μg/mL)。

    1.2.4 衰老小鼠模型的構(gòu)建 參照《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中的方法造模[10]。昆明種小鼠60只,雌雄各半,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,平均分為6組,每組各10只小鼠。各組分別作如下處理:(1)正常對(duì)照組,每天注射生理鹽水;(2)D-半乳糖組,每天注射D-半乳糖;(3)維生素E組,每天注射D-半乳糖及灌胃給藥100 mg/kg的維生素E;(4)白藜蘆醇提取物高劑量組,每天注射D-半乳糖及灌胃給藥150 mg/kg白藜蘆醇提取物;(5)白藜蘆醇提取物中劑量組,每天注射D-半乳糖及灌胃給藥100 mg/kg白藜蘆醇提取物;(6)白藜蘆醇提取物低劑量組,每天注射D-半乳糖及灌胃給藥50 mg/kg的白藜蘆醇提取物。生理鹽水和D-半乳糖注射劑量均為100 mg/kg,所有試驗(yàn)動(dòng)物均食用全價(jià)混合飼料,自由攝取和取水,連續(xù)給藥、灌胃10周。

    1.2.5 白藜蘆醇提取物對(duì)衰老小鼠肝MDA水平、SOD活性、GSH-PX活性的影響 小鼠猝死后,取肝研磨后,參照試劑盒要求,測(cè)定組織研磨液中MDA水平、SOD活性、GSH-PX活性等相關(guān)氧化損傷的指標(biāo)[11-13]。

    1.2.6 白藜蘆醇的純化及質(zhì)譜檢測(cè) 通過硅膠柱層析法對(duì)白藜蘆醇提取物進(jìn)一步分離純化,硅膠與上樣量比為50∶1,流動(dòng)向?yàn)榧状肌寐确?,梯度洗脫后將目?biāo)組分濃縮并溶解于色譜甲醇,0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

    1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用ANOVA方差分析并行方差齊性檢驗(yàn);結(jié)果以x-±s表示。

    2 結(jié)果

    2.1 葡萄籽中白藜蘆醇的提取及含量計(jì)算

    對(duì)乙醇浸提法、熱回流提取、超聲波輔助提取、超聲波輔助雙水相提取等方法對(duì)葡萄籽中的白藜蘆醇進(jìn)行提取,并通過檢測(cè)白藜蘆醇的含量計(jì)算白藜蘆醇提取率。

    比較幾種提取白藜蘆醇的方法,超聲輔助雙水相提取的方法葡萄籽中白藜蘆醇的提取率較高,提取效果較好。達(dá)到2.408 ±0. 088 mg/g采用超聲波集成乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取分離葡萄籽中的白藜蘆醇,同時(shí)具有超聲與雙水相提取的優(yōu)點(diǎn)。具有較好的提取純化效果(圖1)。

    圖1 不同提取方法下的白藜蘆醇提取率

    2.2 MTT法測(cè)定白藜蘆醇提取物對(duì)LO2細(xì)胞的抑制作用

    通過MTT法測(cè)定了葡萄籽中白藜蘆醇提取物對(duì)LO2細(xì)胞的抑制作用,與空白對(duì)照組相比白藜蘆醇提取物濃度(0、5、10、20、40 μg/mL)保護(hù)組表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞無明顯抑制作用。如圖2所示,在0-40 μg/mL濃度的白藜蘆醇提取物作用下,細(xì)胞的抑制率≤10%,說明在0-40 μg/mL濃度下對(duì)白藜蘆醇提取物對(duì)LO2細(xì)胞無明顯抑制作用。

    2.3 白藜蘆醇提取物對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞抗氧化酶活力等指標(biāo)的影響

    與空白對(duì)照組比較,乙醇誘導(dǎo)模型組細(xì)胞裂解液中SOD活性明顯降低,GSH-Px活性明顯下降,MDA水平明顯升高。白藜蘆醇提取物作用于LO2細(xì)胞后,能夠降低乙醇誘導(dǎo)損傷引起的丙二醛(MDA)含量的升高,MDA含量由5.26 nmol/mg 蛋白下降為3.44 nmol/mg 蛋白。提高SOD和GSH-Px活性,SOD活性由15.38 U/mg蛋白升高至16.91 U/mg蛋白,GSH-Px活性由6.45U/mg蛋白升高至8.58 U/mg蛋白。且變化趨勢(shì)均呈明顯的劑量依賴性,如圖3所示。與陽性對(duì)照維生素C(0-40 μg/mL)結(jié)果呈現(xiàn)一致性,維生素C作用LO2細(xì)胞后,MDA含量下降2.38 nmol/mg蛋白,SOD活性上升3.48 U/mg蛋白,GSHPx活性上升3.83 U/mg蛋白。

    圖 2 白藜蘆醇提取物對(duì)LO2細(xì)胞存活率的影響

    圖 3 白藜蘆醇提取物對(duì)SOD、GSH-Px活力及MDA水平的影響

    2.4 白藜蘆醇提取物對(duì)衰老小鼠肝MDA含量、GSH-Px和SOD活力的影響

    本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇提取物灌胃D-半乳糖致衰小鼠一段時(shí)間后,與衰老模型相比,小鼠肝內(nèi)GSH-Px酶活性略有升高,由905.50±30.85升高到940.25±25.73(U/mg prot)。白藜蘆醇提取物對(duì)小鼠肝中MPA的產(chǎn)生有輕微的抑制作用,與衰老模型組小鼠相比,提取物抑制MDA產(chǎn)生,由8.65±2.98降至 7.96±3.98(nmol/mg prot),3個(gè)劑量組MDA含量差異不明顯。同衰老模型組小鼠相比,白藜蘆醇提取物能顯著增強(qiáng)衰老小鼠肝中SOD活性,且隨著提取物濃度的增大,SOD活性增強(qiáng),由112.24±19.85升高至142.38±18.85(U/mg prot),高劑量組飼喂小鼠肝臟中SOD活性的增強(qiáng)較顯著(表1)。

    表1 白藜蘆醇提取物灌胃后衰老小鼠肝MDA含量及GSH-Px和SOD活性

    2.5 白藜蘆醇的純化及質(zhì)譜檢測(cè)

    通過硅膠柱層析法對(duì)白藜蘆醇提取物進(jìn)一步分離純化,洗脫下來富含白藜蘆醇的組分。通過質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇純化組分中含有m/z=226.9的色譜峰,與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品一致,說明該組分中富含白藜蘆醇。

    3 討論

    葡萄籽作為一種葡萄酒產(chǎn)業(yè)的廢棄物,如果能充分利用葡萄籽資源提取白藜蘆醇等多酚類成分,可節(jié)約資源、變廢為寶、保護(hù)環(huán)境。雙水相萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取分離等領(lǐng)域,乙醇-硫酸銨雙水相體系具有黏度小、價(jià)格低、分相清晰、綠色環(huán)保等特點(diǎn),而超聲波輔助提取具有節(jié)省時(shí)間和溶劑、提取效率高等特點(diǎn)。超聲波輔助雙水相提取葡萄籽中白藜蘆醇的研究較少。卜曉英等[14]在研究雙水相萃取虎杖白藜蘆醇提純工藝中,白藜蘆醇含量為0.694%,李一凡等[15]在研究超聲波輔助提取葡萄芪化物工藝條件中,芪化物提取量可達(dá)104.97 μg/g,張喜峰等[16]在研究乙醇 - 硫酸銨雙水相體系分離純化葡萄籽總黃酮時(shí)發(fā)現(xiàn),雙水相體系具有良好的黃酮類化合物萃取能力,總黃酮萃取率達(dá)到98.8%。本研究結(jié)合超聲波和雙水相的優(yōu)勢(shì),白藜蘆醇的提取率達(dá)到了2.408±0.088 mg/g,由于葡萄籽中本身白藜蘆醇的含量與虎杖也有所差別,所以與卜曉英的研究相比提取率略低,但與李一凡的研究相比,提取率較高。對(duì)于葡萄籽提取物對(duì)酒精誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞以及衰老小鼠模型中SOD、GSH-px和MDA含量的影響可反應(yīng)出葡萄籽提取物的抗氧化及保護(hù)細(xì)胞與機(jī)體防御氧化應(yīng)激損傷的能力。對(duì)于這部分的研究目前也較少,周曉云等[17]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)小鼠酒精性肝損傷有抑制作用,因而對(duì)肝細(xì)胞起保護(hù)作用,與本研究結(jié)果一致。白藜蘆醇的功能目前已經(jīng)受到了人們的廣泛認(rèn)可。本課題組也將對(duì)白藜蘆醇的保護(hù)細(xì)胞氧化損傷機(jī)理及延緩衰老功能機(jī)理進(jìn)一步深入研究。

    圖 4 白藜蘆醇及白藜蘆醇純化組分的質(zhì)譜圖

    4 結(jié)論

    本研究通過超聲波輔助雙水相法對(duì)葡萄酒產(chǎn)業(yè)廢棄物葡萄籽進(jìn)行白藜蘆醇的提取純化,白藜蘆醇提取率達(dá)到2.408±0.088 mg/g。白藜蘆醇提取物降低了乙醇誘導(dǎo)引起的丙二醛含量升高,且能顯著提高SOD和GSH-px的活性。白藜蘆醇提取物對(duì)衰老模型小鼠肝中丙二醛的產(chǎn)生有一定的抑制作用,且能夠提升SOD和GSH-px的活性。

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