山茶屬種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SSR 分析

張旻桓，張漢卿，蔡秀蘭，王 海，葉 燁，吳 毅

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.福建鑫禾園林開發(fā)有限公司，福建 三明 365000；3.湖南涉外經(jīng)濟(jì)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

茶花Camellia japonica是山茶科山茶屬植物，中國(guó)十大名花之一，為世界名貴花木[1-2]，其優(yōu)良品種選育長(zhǎng)期受到國(guó)內(nèi)外園藝界的重視[3-6]。已有1 000 多年的栽培歷史，深受人們喜愛。中國(guó)是山茶屬植物的世界分布中心，種質(zhì)資源極其豐富[7-10]。但是，長(zhǎng)期的引種和雜交，使茶花品種的遺傳背景模糊，品種間親緣關(guān)系難以界定，在大樹油茶嫁接茶花時(shí)難以區(qū)別對(duì)待[11-12]。近年來(lái)，有不少企業(yè)進(jìn)行油茶大樹嫁接茶花方式的研究和試驗(yàn)，但茶花實(shí)生苗生長(zhǎng)緩慢[13]，無(wú)法滿足人們對(duì)優(yōu)良名貴茶花品種欣賞的要求，而大量的油茶林產(chǎn)量低、效益差。用山茶花作接穗，嫁接在低產(chǎn)油茶樹上，既可以為改造油茶低產(chǎn)林開辟新的途徑，又可以快速培育茶花。油茶Camellia oleiferaAbel.為山茶屬植物，是直根系樹種，主根發(fā)達(dá)，愈合能力強(qiáng)，適宜用作茶花嫁接砧木。油茶和茶花同為山茶科植物，目前茶花異砧嫁接的常用方法有插皮接、劈接和腹接等，但這些方法僅適合高位換接和樹姿整形，不具備大規(guī)模繁殖的能力。但油茶大樹移栽后進(jìn)行茶花嫁接還存在較多問題，為了提高油茶根接茶花的成活率，試驗(yàn)研究了基因型對(duì)油茶嫁接茶花成活率的影響[14]。

SSR（simple sequence repeat）標(biāo)記是目前較常用的分子標(biāo)記之一[15]。SSR 標(biāo)記具有數(shù)量豐富、等位基因變異多、共顯性遺傳、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、易于分析等優(yōu)點(diǎn)[16]。隨著山茶屬植物的SSR 引物被陸續(xù)開發(fā)[17]，SSR 標(biāo)記已經(jīng)被用于山茶屬植物的遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定和遺傳多樣性及親緣關(guān)系的分析[18-21]。

福建鑫禾園林開發(fā)有限公司種質(zhì)資源圃收集和保存國(guó)內(nèi)外茶花種質(zhì)128 份，其中有從大田選育出的優(yōu)良變異植株。本研究中應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記，將36 份花形、花色、花香等受到人們喜愛的品種進(jìn)行親緣關(guān)系比較分析，以期為優(yōu)化油茶大樹嫁接茶花技術(shù)，提高嫁接成活率提供參考，同時(shí)為茶花的鑒定及分類、種質(zhì)資源的保存和合理利用提供參考[22-25]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年5月，在福建省明溪縣福建鑫禾園林林業(yè)開發(fā)有限公司茶花種質(zhì)資源圃，選生長(zhǎng)健壯且無(wú)病蟲危害植株的幼嫩葉片，用保鮮袋編號(hào)封存后以變色硅膠干燥備用。各試驗(yàn)材料的編號(hào)及名稱見表1。

表1 試驗(yàn)材料的編號(hào)及名稱Table 1 No.and names of test materials

2017年7～11月在中南林業(yè)科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)中使用Ueno 等從山茶屬植物篩選的12 對(duì)SSR 引物（見表2），由上海生工生物公司合成，試驗(yàn)用的TaqDNA 聚合酶、dNTPs 等試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組提取與檢測(cè)

以改良CTAB 法提取樣品總DNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取液中核酸質(zhì)量和濃度，以ddH2O稀釋至25 ng/mL 后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 12對(duì)SSR引物的基本信息Table 2 Basic information of 12 pairs of SSR primers

1.2.2 SSR-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化

以品種‘紅露珍’DNA 為模板，對(duì)Mg2＋、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、引物以及DNA 模板進(jìn)行篩選。SSR-PCR 反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)比較和優(yōu)化確定為20 μL，其中包括模板DNA 20 ng、10×Buffer 2 μL、25 mmol/L MgCl20.8 μL、2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL、 引 物 各0.4 μL、TaqDNA 聚 合 酶1 U、ddH2O 10 μL。再以12個(gè)茶花品種（分別為‘赤丹’、‘白雪塔’‘宮粉’‘金杯’‘東紅’‘皇冠’‘賓司’‘美蘭’‘海艷’‘玫瑰茶’‘圣潔’和‘花露珍’）的基因組DNA為模板，按初選的最優(yōu)反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)該體系對(duì)不同茶花品種的適用性[1]。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)

反應(yīng)在eppendorf熱循環(huán)儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃度預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，相應(yīng)的退火溫度復(fù)性45 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸8 min，8 ℃保存。每份擴(kuò)增產(chǎn)物各加入6×溴酚藍(lán)1.5 mL，輕微振動(dòng)混勻，取2.0 mL 產(chǎn)物在8.0%聚丙烯酰胺凝膠上電泳后銀染顯色，使用FR-200 全自動(dòng)紫外與可見光凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4 PCR 數(shù)據(jù)分析

每對(duì)SSR 引物檢測(cè)1 個(gè)位點(diǎn)，每條多態(tài)性帶代表1個(gè)等位基因。遺傳聚類（genetic clustering）是反映居群間相似性的一種有效方法，首先計(jì)算居群間的遺傳距離（D），其值可以從0 至無(wú)限大，然后利用POPTREE2軟件采用非加權(quán)平均聚類法（UPGMA）繪制聚類圖[26]，分析遺傳距離和種質(zhì)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

12 對(duì)SSR 引物均能擴(kuò)增出清晰的譜帶，共擴(kuò)增出138 條譜帶，其中多態(tài)性譜帶134 條，多態(tài)性比率為97.06%。每對(duì)引物檢測(cè)到的多態(tài)性譜帶范圍為11～16，平均多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為12.80，多態(tài)性比例范圍為83.67%～100%。

從76 對(duì)SSR 引物中篩選出12 對(duì)引物用于茶花材料的SSR 擴(kuò)增（見表2），經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，退火溫度見表2。12 對(duì)引物擴(kuò)增的譜帶清晰，且多態(tài)性豐富（見圖1）。單條引物擴(kuò)增的條帶為5～36 條，平均23.7 條。多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）變幅為0.686 8～0.964 0，平均為0.908 4，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100～1 650 bp，以150～750 bp 的擴(kuò)增片段居多。擴(kuò)增條帶數(shù)最少的引物為VVMD19，僅擴(kuò)增出5 條條帶；擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物為UDV-033，多達(dá)36 條。引物UDV-041 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度范圍最大，為80～900 bp；引物VVMD19 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度范圍最小，為180～420 bp。8 對(duì)引物共擴(kuò)增出190 條條帶，均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為100%。

圖1 樣品在PS153 擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳檢測(cè)Fig.1 Capollary electroperrogram obtained by PS153

2.2 親緣關(guān)系聚類分析

以各品種12 對(duì)引物的擴(kuò)增帶型為基礎(chǔ)，用NTSYS 軟件進(jìn)行UPGMA 法聚類，分析得出36份茶花的聚類圖（見圖2）。各品種間遺傳相似系數(shù)范圍為0.62～0.95，平均相似系數(shù)為0.793。以遺傳相似系數(shù)0.624 為標(biāo)準(zhǔn)，可將所有供試材料分為2 個(gè)類群A 和B。A 類中油茶單獨(dú)聚類，另外包括1 份茶花品種‘春詩(shī)’，在遺傳相似系數(shù)0.664 處又分為4 個(gè)亞類，即A1、A2、A3 和A4。A1 亞類包括‘云斑大元帥’ ‘太陽(yáng)頌’‘茶梅’‘南海明珠’‘紅荷花’‘休斯富豪’‘耐冬’‘粉十八’‘皇家天鵝絨’‘七星紅’；A2 亞類包括‘紅露珍’‘花露珍’‘牡丹皇后’‘金獎(jiǎng)牡丹’‘四季茶花’‘花仙子’‘旭之舞’；A3 亞類有‘美國(guó)大紅’；A4 亞類有‘布魯克氏玫瑰’‘正黃旗’‘豪斯’，且在相似系數(shù)0.725 處可進(jìn)一步劃分為2 組，第1 組為‘撒琳佛那禮’‘雅特詩(shī)’‘黑絨帶’‘香茶花’‘五色赤丹’‘赤丹’‘蘇圣尼’；第2組為‘火爆布’‘丹巴通’‘迪斯’‘碧玉’‘斑阿波羅’‘花寶珠’。研究結(jié)果表明，SSR 分子標(biāo)記適合于茶花親緣關(guān)系的研究，組間水平的聚類與形態(tài)分類相吻合。

圖2 根據(jù)SSR 結(jié)果構(gòu)建的36 個(gè)茶花品種的親緣關(guān)系Fig.2 Genetic relationship of 36 cultivars of C.japonic based on SSR result

3 結(jié)論與討論

3.1 茶花品種鑒定

EST-SSR 作為一種與基因表達(dá)相關(guān)的SSR 分子標(biāo)記，不僅具備傳統(tǒng)基因組SSR 標(biāo)記的共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，而且因開發(fā)經(jīng)濟(jì)、通用性高及性狀連鎖等優(yōu)勢(shì)已在很多植物研究中得到開發(fā)和應(yīng)用。然而，基于ESR-SSR 標(biāo)記進(jìn)行茶花種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析報(bào)道較為鮮見，且標(biāo)記數(shù)目有限。本研究中利用12對(duì)SSR 引物對(duì)茶花品種的遺傳背景進(jìn)行分析，篩選出的12對(duì)SSR引物能夠?qū)⑷抗┰嚥牧蠀^(qū)分開。12 對(duì)引物均能成功擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)， 36 份品種資源具有復(fù)雜的遺傳背景。由于目前國(guó)內(nèi)外茶花品種雜合度高，一些品種往往聚類于不同的群或亞群內(nèi)，表明不同品種即使單一性狀相同也不一定能聚類到一起。一方面，可能是由于供試的茶花品種數(shù)量不夠大或可用標(biāo)記數(shù)有限，不足以形成一個(gè)與形態(tài)學(xué)特征相一致的清晰的區(qū)分模式；另一方面，也可能是供試的栽培茶花品種因種內(nèi)或品種內(nèi)發(fā)生雜交從而形成了較高的遺傳多樣性，而聚類結(jié)果又同時(shí)受到多種形態(tài)學(xué)性狀的影響。此外，也可能因茶花品種繁多，部分品種遺傳背景復(fù)雜或不清，前人根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行分類可能存在錯(cuò)誤。

3.2 親緣關(guān)系分析

分析茶花品種資源的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，對(duì)于大樹油茶嫁接茶花的工作具有重要的指導(dǎo)意義。試驗(yàn)結(jié)果表明，在大樹油茶嫁接時(shí)，選擇‘云斑大元帥’‘太陽(yáng)頌’‘茶梅’‘紅露珍’和‘美國(guó)大紅’等與油茶親緣關(guān)系較近的品種更容易嫁接成功，在實(shí)際嫁接時(shí)，基本與試驗(yàn)結(jié)果相吻合。SSR 分子標(biāo)記能靈敏地揭示2 個(gè)親緣關(guān)系十分相近個(gè)體間的差異，該試驗(yàn)結(jié)果表明，聚類分析中部分地理來(lái)源相同或遺傳背景相似的品種資源能夠聚在同一類群，但也有一些地理來(lái)源及遺傳背景不一致的品種資源聚集在同一類群，顯示了復(fù)雜的親緣關(guān)系。茶花有著悠久的栽培歷史，在長(zhǎng)期的栽培中，遺傳資源不斷交流，品種數(shù)量不均勻，這導(dǎo)致聚類結(jié)果的不規(guī)律，難以準(zhǔn)確區(qū)分近似品種的類型，而更難以準(zhǔn)確劃分同類型的品種，也難以弄清楚一些品種間的親緣關(guān)系及演化；所用引物數(shù)量不夠，所檢測(cè)位點(diǎn)較少，使得各品種間的遺傳變異估算發(fā)生偏差。SSR分子標(biāo)記反映物種間遺傳物質(zhì)的差異，不易受外界條件影響，但因覆蓋的基因組有限，在種質(zhì)資源分類及親緣關(guān)系研究中，進(jìn)行大范圍的評(píng)價(jià)和開發(fā)大量的標(biāo)記時(shí)，可將形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記兩者相結(jié)合來(lái)揭示茶花品種間的親緣關(guān)系。