高脂血癥大鼠下頜下腺水通道蛋白2和4的表達

楊玥欣　沈夏波　武雅靜　桂　麗　賈雪梅

(安徽醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，安徽　合肥　230032)

研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥患者伴隨有口渴的癥狀，這可能與下頜下腺的唾液分泌功能異常有關(guān)〔1〕。水通道蛋白(AQPs)是一類具有轉(zhuǎn)運水和其他小分子可溶物的蛋白質(zhì)家族，在唾液分泌過程中起重要作用。AQP2是唯一一種功能受控的AQP5，AQP5可能是AQP2表達的校準器〔2〕。高脂血癥大鼠下頜下腺中AQP5的表達存在異常〔1〕，但AQP2 的表達是否隨之改變還未闡明。AQP4可在細胞間快速轉(zhuǎn)運水，且該作用受AQP4四聚體結(jié)構(gòu)的阻礙〔3〕。AQP4在高脂血癥患者下頜下腺的表達變化也不清楚。本實驗觀察高脂血癥組大鼠下頜下腺AQP2和AQP4的表達變化。

1　材料和方法

1.1試劑AQP2和AQP4的抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)、SP 免疫組織化學試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2高脂血癥動物模型復制雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量110～160 g，安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，普通級，隨機分為兩組，每組10只。對照組予以全價飼料喂養(yǎng)；高脂血癥組給予高脂飲食(膽固醇 2%、 豬油10%、 基礎(chǔ)飼料 88%)，復制高脂血癥模型；連續(xù)觀察2個月，各組動物均不限制飲食和飲水。

1.3標本制備用20%烏拉坦1 ml/100 g，腹腔注射，麻醉后剖開腹腔，下腔靜脈取血，行三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)檢測；取下頜下腺固定于10%甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋，切片4 μm。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色切片脫蠟至水，入蘇木精染色15 min，再進行鹽酸乙醇分色、藍化、伊紅染色、脫水、透明和封片，顯微鏡下觀察下頜下腺病理學改變。

1.5免疫組化染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液修復，微波爐高火8 min，靜置3 min，再高火4 min，冷卻至室溫。3%H2O2，37℃孵育20 min；滴加AQP2一抗溶液(1∶200)和AQP4一抗溶液(1∶100)，滴加50 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，4℃過夜，切片從冰箱取出恢復至室溫；滴加二抗(生物素標記的山羊抗兔的IgG)，37℃孵育30 min；辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。以上步驟之間都以PBS沖洗3次×3 min。滴加DAB顯色3 min。自來水沖洗；蘇木精復染，放入自來水中藍化，脫水，透明和封片。在10×40倍光鏡下，利用Nikon彩色數(shù)碼CCD攝像頭捕獲各組切片中AQP2和AQP4的圖像，每張切片隨機選取6個視野，再用捷達生物圖像軟件計算各組AQP2和AQP4免疫陽性細胞的平均光密度值(MOD)。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1兩組血脂水平比較對照組TG〔(0.784 8±0.212 7)mmol/L〕、TC〔(1.250 6±0.353 9)mmol/L〕水平明顯低于高脂血癥組〔(2.761 8±0.526 0)mmol/L、(5.822 3±0.981 9)mmol/L，P<0.05〕。

2.2兩組下頜下腺病理學觀察對照組大鼠腺泡飽滿，結(jié)構(gòu)清晰。高脂血癥組大鼠腺泡萎縮，直徑變小，可見結(jié)締組織增生，見圖1。

2.3兩組下頜下腺AQP2免疫組化表達對照組和高脂血癥組大鼠下頜下腺AQP2都呈陽性，大多呈棕褐色。在黏液性腺泡區(qū)，AQP2免疫陽性反應物主要沉積于紋狀管導管上皮胞質(zhì)內(nèi)；在漿液性腺泡區(qū)，AQP2主要在紋狀管表達，腺泡中也有表達，而顆粒曲管中則無表達，見圖2。對照組(0.926 1±0.066 2)和高脂血癥組下頜下腺AQP2表達差異無統(tǒng)計學意義(0.981 9±0.177 9,P>0.05)。

2.4兩組下頜下腺AQP4免疫組化表達在黏液性腺泡區(qū)，對照組、高脂血癥組下頜下腺AQP4免疫陽性反應物主要沉積在紋狀管導管上皮細胞，呈棕褐色；在漿液性腺泡區(qū)，AQP4主要表達在紋狀管，腺泡中也有表達，但顆粒曲管中無表達，見圖3。與對照組(1.098 6±0.083 4)相比，高脂血癥組AQP4免疫陽性反應物表達明顯減弱(1.009 8±0.086 6,t=2.374,P<0.05)，呈淺棕黃色。

圖1　兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)組織結(jié)構(gòu)(HE，×400)

圖2　兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)AQP2表達(DAB，×400)

圖3　兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)AQP4表達(DAB，×400)

3　討　論

AQP2主要表達在腎臟結(jié)合小管和集合管的主細胞，與糖尿病腎病關(guān)系密切〔2,4,5〕。本文結(jié)果顯示，與正常大鼠比較，高脂血癥大鼠下頜下腺AQP2的表達無明顯變化。AQP2的量和細胞定位受到多種激素和信號分子的影響，包括精氨酸加壓素(AVP)。高鈉血癥或低血容量時，AVP從垂體后葉分泌到血流中〔6〕，它促成細胞內(nèi)從小囊泡到頂膜的AQP2水通道蛋白的重新分配〔7〕，增強水的重吸收及其跨膜轉(zhuǎn)運〔5〕。AVP受體主要存在于全身血管平滑肌、腎臟遠端后端和集合管上皮細胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔8〕，而目前尚未有AVP受體在大鼠下頜下腺中表達的報道。據(jù)此推測，AVP受體在大鼠下頜下腺中表達含量過低或不表達可能導致高脂血癥大鼠AQP2的表達不受影響。AQP4廣泛分布于體內(nèi)，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎、肺、結(jié)腸，也可在支氣管上皮表達〔9〕。有實驗證明AQP4在干燥綜合征大鼠下頜下腺表達〔10〕，AQP4是維持下頜下腺水平衡的重要水通道蛋白，在唾液形成的過程中有重要的作用。本文顯示與正常大鼠比較，高脂血癥大鼠下頜下腺AQP4的表達明顯下降，據(jù)此推測，AQP4表達減少會導致下頜下腺導管對水的轉(zhuǎn)運功能下降，引起唾液的分泌量減少，這可能是導致高脂血癥患者口渴的原因之一。AQP4表達減少的原因可能有：①缺血缺氧使AQP4的表達發(fā)生改變。據(jù)報道，缺氧/缺血 24 h后，大腦組織中血管和突觸周圍星形膠質(zhì)細胞足突上的AQP4 表達下降，使星形膠質(zhì)細胞死亡〔11〕。而高脂血癥的直接損害是加速全身動脈粥樣硬化，一旦動脈被粥樣斑塊堵塞，就會導致局部組織如下頜下腺缺氧缺血，引起AQP4 表達下降。②高脂血癥時游離的脂肪酸和TG的升高導致胰島素抵抗，下頜下腺組織出現(xiàn)葡萄糖代謝障礙，導致AQP4合成能量不足，AQP4表達下降。③蛋白激酶C和MAPKs信號通路參與AQP4的表達調(diào)節(jié)〔12〕，有研究表明在高脂血癥大鼠的胰腺中蛋白激酶C活化，據(jù)此推測，蛋白激酶C激活可以抑制下頜下腺中的AQP4基因的表達，減少mRNA的產(chǎn)生〔13〕。而高脂血癥大鼠血液中的TG和TC的慢性刺激可誘導蛋白激酶C的活化，使下頜下腺AQP4表達減少。④根據(jù)翻譯起始處蛋氨酸M1和M23的不同，將AQP4分為兩個亞型，內(nèi)源性AQP4是同時含有M1(含 323 個氨基酸 )和M23(含有 301 個氨基酸)的四聚體，它們共同組成四聚體存在于細胞膜上〔14〕。高脂血癥大鼠下頜下腺中也可能由于AQP4亞型結(jié)合的比例失調(diào)，導致表達的下降，使其轉(zhuǎn)運水的功能發(fā)生改變。

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