高脂血癥大鼠下頜下腺水通道蛋白2和4的表達(dá)

楊玥欣　沈夏波　武雅靜　桂　麗　賈雪梅

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，安徽　合肥　230032)

研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥患者伴隨有口渴的癥狀，這可能與下頜下腺的唾液分泌功能異常有關(guān)〔1〕。水通道蛋白(AQPs)是一類(lèi)具有轉(zhuǎn)運(yùn)水和其他小分子可溶物的蛋白質(zhì)家族，在唾液分泌過(guò)程中起重要作用。AQP2是唯一一種功能受控的AQP5，AQP5可能是AQP2表達(dá)的校準(zhǔn)器〔2〕。高脂血癥大鼠下頜下腺中AQP5的表達(dá)存在異?！?〕，但AQP2 的表達(dá)是否隨之改變還未闡明。AQP4可在細(xì)胞間快速轉(zhuǎn)運(yùn)水，且該作用受AQP4四聚體結(jié)構(gòu)的阻礙〔3〕。AQP4在高脂血癥患者下頜下腺的表達(dá)變化也不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察高脂血癥組大鼠下頜下腺AQP2和AQP4的表達(dá)變化。

1　材料和方法

1.1試劑AQP2和AQP4的抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)、SP 免疫組織化學(xué)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2高脂血癥動(dòng)物模型復(fù)制雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量110～160 g，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，普通級(jí)，隨機(jī)分為兩組，每組10只。對(duì)照組予以全價(jià)飼料喂養(yǎng)；高脂血癥組給予高脂飲食(膽固醇 2%、 豬油10%、 基礎(chǔ)飼料 88%)，復(fù)制高脂血癥模型；連續(xù)觀(guān)察2個(gè)月，各組動(dòng)物均不限制飲食和飲水。

1.3標(biāo)本制備用20%烏拉坦1 ml/100 g，腹腔注射，麻醉后剖開(kāi)腹腔，下腔靜脈取血，行三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)檢測(cè)；取下頜下腺固定于10%甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋，切片4 μm。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色切片脫蠟至水，入蘇木精染色15 min，再進(jìn)行鹽酸乙醇分色、藍(lán)化、伊紅染色、脫水、透明和封片，顯微鏡下觀(guān)察下頜下腺病理學(xué)改變。

1.5免疫組化染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)，微波爐高火8 min，靜置3 min，再高火4 min，冷卻至室溫。3%H2O2，37℃孵育20 min；滴加AQP2一抗溶液(1∶200)和AQP4一抗溶液(1∶100)，滴加50 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，4℃過(guò)夜，切片從冰箱取出恢復(fù)至室溫；滴加二抗(生物素標(biāo)記的山羊抗兔的IgG)，37℃孵育30 min；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。以上步驟之間都以PBS沖洗3次×3 min。滴加DAB顯色3 min。自來(lái)水沖洗；蘇木精復(fù)染，放入自來(lái)水中藍(lán)化，脫水，透明和封片。在10×40倍光鏡下，利用Nikon彩色數(shù)碼CCD攝像頭捕獲各組切片中AQP2和AQP4的圖像，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，再用捷達(dá)生物圖像軟件計(jì)算各組AQP2和AQP4免疫陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(MOD)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1兩組血脂水平比較對(duì)照組TG〔(0.784 8±0.212 7)mmol/L〕、TC〔(1.250 6±0.353 9)mmol/L〕水平明顯低于高脂血癥組〔(2.761 8±0.526 0)mmol/L、(5.822 3±0.981 9)mmol/L，P<0.05〕。

2.2兩組下頜下腺病理學(xué)觀(guān)察對(duì)照組大鼠腺泡飽滿(mǎn)，結(jié)構(gòu)清晰。高脂血癥組大鼠腺泡萎縮，直徑變小，可見(jiàn)結(jié)締組織增生，見(jiàn)圖1。

2.3兩組下頜下腺AQP2免疫組化表達(dá)對(duì)照組和高脂血癥組大鼠下頜下腺AQP2都呈陽(yáng)性，大多呈棕褐色。在黏液性腺泡區(qū)，AQP2免疫陽(yáng)性反應(yīng)物主要沉積于紋狀管導(dǎo)管上皮胞質(zhì)內(nèi)；在漿液性腺泡區(qū)，AQP2主要在紋狀管表達(dá)，腺泡中也有表達(dá)，而顆粒曲管中則無(wú)表達(dá)，見(jiàn)圖2。對(duì)照組(0.926 1±0.066 2)和高脂血癥組下頜下腺AQP2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.981 9±0.177 9,P>0.05)。

2.4兩組下頜下腺AQP4免疫組化表達(dá)在黏液性腺泡區(qū)，對(duì)照組、高脂血癥組下頜下腺AQP4免疫陽(yáng)性反應(yīng)物主要沉積在紋狀管導(dǎo)管上皮細(xì)胞，呈棕褐色；在漿液性腺泡區(qū)，AQP4主要表達(dá)在紋狀管，腺泡中也有表達(dá)，但顆粒曲管中無(wú)表達(dá)，見(jiàn)圖3。與對(duì)照組(1.098 6±0.083 4)相比，高脂血癥組AQP4免疫陽(yáng)性反應(yīng)物表達(dá)明顯減弱(1.009 8±0.086 6,t=2.374,P<0.05)，呈淺棕黃色。

圖1　兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)組織結(jié)構(gòu)(HE，×400)

圖2　兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)AQP2表達(dá)(DAB，×400)

圖3　兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)AQP4表達(dá)(DAB，×400)

3　討　論

AQP2主要表達(dá)在腎臟結(jié)合小管和集合管的主細(xì)胞，與糖尿病腎病關(guān)系密切〔2,4,5〕。本文結(jié)果顯示，與正常大鼠比較，高脂血癥大鼠下頜下腺AQP2的表達(dá)無(wú)明顯變化。AQP2的量和細(xì)胞定位受到多種激素和信號(hào)分子的影響，包括精氨酸加壓素(AVP)。高鈉血癥或低血容量時(shí)，AVP從垂體后葉分泌到血流中〔6〕，它促成細(xì)胞內(nèi)從小囊泡到頂膜的AQP2水通道蛋白的重新分配〔7〕，增強(qiáng)水的重吸收及其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)〔5〕。AVP受體主要存在于全身血管平滑肌、腎臟遠(yuǎn)端后端和集合管上皮細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔8〕，而目前尚未有AVP受體在大鼠下頜下腺中表達(dá)的報(bào)道。據(jù)此推測(cè)，AVP受體在大鼠下頜下腺中表達(dá)含量過(guò)低或不表達(dá)可能導(dǎo)致高脂血癥大鼠AQP2的表達(dá)不受影響。AQP4廣泛分布于體內(nèi)，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎、肺、結(jié)腸，也可在支氣管上皮表達(dá)〔9〕。有實(shí)驗(yàn)證明AQP4在干燥綜合征大鼠下頜下腺表達(dá)〔10〕，AQP4是維持下頜下腺水平衡的重要水通道蛋白，在唾液形成的過(guò)程中有重要的作用。本文顯示與正常大鼠比較，高脂血癥大鼠下頜下腺AQP4的表達(dá)明顯下降，據(jù)此推測(cè)，AQP4表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致下頜下腺導(dǎo)管對(duì)水的轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，引起唾液的分泌量減少，這可能是導(dǎo)致高脂血癥患者口渴的原因之一。AQP4表達(dá)減少的原因可能有：①缺血缺氧使AQP4的表達(dá)發(fā)生改變。據(jù)報(bào)道，缺氧/缺血 24 h后，大腦組織中血管和突觸周?chē)切文z質(zhì)細(xì)胞足突上的AQP4 表達(dá)下降，使星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡〔11〕。而高脂血癥的直接損害是加速全身動(dòng)脈粥樣硬化，一旦動(dòng)脈被粥樣斑塊堵塞，就會(huì)導(dǎo)致局部組織如下頜下腺缺氧缺血，引起AQP4 表達(dá)下降。②高脂血癥時(shí)游離的脂肪酸和TG的升高導(dǎo)致胰島素抵抗，下頜下腺組織出現(xiàn)葡萄糖代謝障礙，導(dǎo)致AQP4合成能量不足，AQP4表達(dá)下降。③蛋白激酶C和MAPKs信號(hào)通路參與AQP4的表達(dá)調(diào)節(jié)〔12〕，有研究表明在高脂血癥大鼠的胰腺中蛋白激酶C活化，據(jù)此推測(cè)，蛋白激酶C激活可以抑制下頜下腺中的AQP4基因的表達(dá)，減少mRNA的產(chǎn)生〔13〕。而高脂血癥大鼠血液中的TG和TC的慢性刺激可誘導(dǎo)蛋白激酶C的活化，使下頜下腺AQP4表達(dá)減少。④根據(jù)翻譯起始處蛋氨酸M1和M23的不同，將AQP4分為兩個(gè)亞型，內(nèi)源性AQP4是同時(shí)含有M1(含 323 個(gè)氨基酸 )和M23(含有 301 個(gè)氨基酸)的四聚體，它們共同組成四聚體存在于細(xì)胞膜上〔14〕。高脂血癥大鼠下頜下腺中也可能由于A(yíng)QP4亞型結(jié)合的比例失調(diào)，導(dǎo)致表達(dá)的下降，使其轉(zhuǎn)運(yùn)水的功能發(fā)生改變。

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