女貞子提取物對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練力竭后大鼠肝組織自由基代謝的影響

張　輝

(南京審計(jì)大學(xué)體育部，江蘇　南京　211815)

女貞子具有補(bǔ)腎滋陰、養(yǎng)肝明目的藥理作用〔1〕。女貞子果實(shí)中含有多種抗氧化活性物質(zhì)，易溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑，并且可間接影響機(jī)體的自由基代謝活動(dòng)，其中齊墩果酸是其中最主要的脂溶性抗氧化物質(zhì)〔2〕。女貞子既往研究多針對(duì)女貞子提取物對(duì)機(jī)體的抗氧化效應(yīng)〔3，4〕，對(duì)自由基代謝影響的研究還尚未深入。本研究主要探究女貞子提取物對(duì)大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練力竭后大鼠肝組織自由基代謝的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)選取SD雄性8周齡大鼠45只，體重(20.00±5.32)g，動(dòng)物飼養(yǎng)房溫度為(23 ± 5)℃，相對(duì)濕度為50%～70%，由專(zhuān)業(yè)飼養(yǎng)員進(jìn)行飼養(yǎng)，提供正常的飲用水和飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行耐力訓(xùn)練。

1.2女貞子活性物質(zhì)的提取女貞子采自陜西，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院植物研究所鑒定?；钚晕镔|(zhì)提取步驟：將采摘的女貞子果實(shí)潔凈晾干后放于恒溫烘箱中烘干，用研缽粉碎過(guò)40目篩后存放在干燥處備用。稱(chēng)取果實(shí)研碎粉末30 g置于錐形瓶中，按固液比1∶10的比例分別加入95%乙醇，同時(shí)采用靜置、攪拌、加熱回流等手段使溶劑與原料充分接觸。最后，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間浸泡使原料中的化學(xué)成分溶解于溶劑中。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及訓(xùn)練在耐力訓(xùn)練前將45只大鼠隨機(jī)分為安靜組、運(yùn)動(dòng)組、實(shí)驗(yàn)組各15只。耐力訓(xùn)練前，分別給安靜組和運(yùn)動(dòng)組小鼠灌胃1 ml生理鹽水，給實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃1 ml女貞子提取物，每天1次，持續(xù)7 d。之后對(duì)運(yùn)動(dòng)組和實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行6 w的耐力訓(xùn)練，每天訓(xùn)練前以15 m/min的速度做適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)5 min后再進(jìn)行正式訓(xùn)練，訓(xùn)練模型根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整的Bedford模型〔5〕。安靜組小鼠不做處理，繼續(xù)適應(yīng)性喂養(yǎng)，保持正常的生理活動(dòng)。

1.4制備大鼠肝組織樣本經(jīng)過(guò)6 w耐力訓(xùn)練后，斷頭處死大鼠，取大鼠肝臟后用濾紙吸干，稱(chēng)重，將大鼠肝臟研磨制備10%勻漿液，4℃，3 500 r/min離心5 min，取上清液，置于4℃冰箱保存待測(cè)。

1.5活性物質(zhì)檢測(cè)

1.5.1黃嘌呤氧化酶法測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活性〔6〕準(zhǔn)備好測(cè)定管和對(duì)照管，在測(cè)定管中加好試劑和待測(cè)樣品，對(duì)照管中不加任何待測(cè)樣品。黃嘌呤氧化酶法試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，測(cè)定操作方法遵照試劑盒說(shuō)明書(shū)。用漩渦振蕩器充分混勻，置37℃水浴30 min。在兩管中分別加入1ml顯色劑，混勻，室溫放置10 min，蒸餾水調(diào)零，測(cè)A530。SOD活力(U/ml)=(A2-A1)/A2×100%÷50%×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)，A1：測(cè)定管的吸光值；A2：空白管的吸光值。

1.5.2Fe2+與菲啉類(lèi)物絡(luò)合法測(cè)定總抗氧化能力(T-AOC)〔7〕T-AOC檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。對(duì)照說(shuō)明書(shū)在試管中加入相應(yīng)試劑和100 μl肝組織勻漿，漩渦混勻器混勻，37℃水浴30 min，加入蒸餾水100 μl，測(cè)其吸收度。對(duì)照試管中加入相應(yīng)試劑后加入100 μl蒸餾水，測(cè)其吸光度。T-AOC=(測(cè)定管OD-對(duì)照管OD)/0.01/30×稀釋倍數(shù)。

1.5.3鉬酸銨法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性〔8〕配制65 mmol/L H2O2基液(過(guò)氧化氫酶測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供)。CAT檢測(cè)：設(shè)置空白管、自身對(duì)照管、測(cè)定管，空白管中只加入CAT Assay buffer和65 mmol/L H2O2基液，自身對(duì)照管和測(cè)定管中則加入待測(cè)樣品和65 mmol/L H2O2基液。立即混勻，置于水浴，準(zhǔn)確孵育。每管中加入1 ml MO顯色液。分光光度計(jì)檢測(cè)405 nm處吸光度。組織樣品CAT活力(U/mg)=〔(A自身對(duì)照-A測(cè)定)/A測(cè)定〕×650/待測(cè)樣品血紅蛋白濃度(mg/ml)。

1.5.4TBA比色法測(cè)丙二醛(MDA)含量〔9〕將上述上清液用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以便于后續(xù)計(jì)算單位蛋白重量組織細(xì)胞內(nèi)的MDA含量。MDA檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。提前配制TBA工作液置于4℃避光保存。在離心管加入勻漿上清液、裂解液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水等適當(dāng)溶液做空白對(duì)照(注意：待測(cè)樣品為血清、血漿時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用生理鹽水稀釋?zhuān)淮郎y(cè)樣品為勻漿液時(shí)用相同溶液稀釋)。隨后加入4.14 ml MDA檢測(cè)工作液。將上述試劑混勻，水浴煮沸。水浴冷卻至室溫，離心。取上清，蒸餾水調(diào)零，用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測(cè)523 nm或535 nm處吸光值。MDA濃度(μmol/mg)=(OD測(cè)定-OD空白)/(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白)×10蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/ml)。

1.5.5比色法檢測(cè)大鼠肝組織乳酸脫氫酶(LDH)活性〔10〕丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中預(yù)熱。取一只比色杯中加入磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液，置于紫外分光光度計(jì)中，在340 nm處將光吸收調(diào)節(jié)至零。取另一只比色杯用于測(cè)定LDH活性，依次加入丙酮酸鈉溶液和NADH溶液，加蓋搖勻后，測(cè)定340 nm吸光值(A)。隨后，取出比色杯，加入經(jīng)稀釋的酶液10 μl，搖勻，每隔5 min測(cè)A340 nm。LDH活力(U/ml)=(A340 nm×稀釋倍數(shù))/(酶液加入量)×10-1。LDH活性檢測(cè)采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)　果

2.1各組體質(zhì)量、力竭時(shí)間及肝組織質(zhì)量的變化比較注射女貞子提取物或耐力訓(xùn)練后，相對(duì)安靜組，運(yùn)動(dòng)組力竭游泳時(shí)間和體質(zhì)量增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。而運(yùn)動(dòng)組肝組織質(zhì)量相對(duì)安靜組增加顯著(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組力竭游泳時(shí)間和體質(zhì)量相對(duì)安靜組、運(yùn)動(dòng)組顯著增加(均P<0.05)，肝組織質(zhì)量雖有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組體質(zhì)量、力竭時(shí)間變化比較

與安靜組比較：1)P<0.05；與運(yùn)動(dòng)組比較：2)P<0.05；下表同

2.23組各指標(biāo)活性變化運(yùn)動(dòng)組SOD、T-AOC、CAT活性相對(duì)安靜組有一定下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而MDA、LDH活性有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組SOD、T-AOC、CAT活性相對(duì)安靜組、運(yùn)動(dòng)組有一定提高，MDA、LDH活性有所下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　女貞子提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織SOD、T-AOC、CAT、MDA、LDH活性的影響

3　討　論

機(jī)體日常生命活動(dòng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，尤其在進(jìn)行耐力運(yùn)動(dòng)后，自由基過(guò)多對(duì)人體造成一定副作用〔11〕，其對(duì)人體的攻擊首先從細(xì)胞膜開(kāi)始，細(xì)胞膜極富彈性和柔韌性，電子極容易丟失，細(xì)胞膜彈性及其相關(guān)功能均隨之喪失。由于細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)遭到破壞，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)各種疾病〔12〕。此外，自由基還會(huì)攻擊蛋白質(zhì)并對(duì)基因進(jìn)行破壞，參與機(jī)體生命活動(dòng)的蛋白質(zhì)酶類(lèi)遭受侵襲導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致基因突變。

本研究顯示運(yùn)動(dòng)和服用女貞子提取物均能影響機(jī)體參與自由基代謝相關(guān)酶類(lèi)的活性，從而間接影響大鼠肝組織的自由基代謝反應(yīng)。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，是一種很好的抗氧化物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，人體不斷補(bǔ)充SOD會(huì)有一定的抗衰老效果〔13，14〕。T-AOC反映機(jī)體的總抗氧化能力，代表體系中大小分子和酶總和的水平，適當(dāng)運(yùn)動(dòng)背景下，機(jī)體自由基代謝處在相對(duì)平衡的狀態(tài)，SOD活性和T-AOC會(huì)得到加強(qiáng)，但耐力訓(xùn)練之后機(jī)體自由基代謝紊亂，活性和抗氧化能力自然會(huì)有所下降。CAT是一類(lèi)催化能力極強(qiáng)的過(guò)氧化氫酶和氧化還原酶，以鐵卟啉為輔基，CAT能催化體內(nèi)的過(guò)氧化氫分解反應(yīng)，能清除自由基〔15，16〕，在維持細(xì)胞氧化與抗氧化活性物質(zhì)的平衡上具有重要意義。耐力運(yùn)動(dòng)后，CAT活性減弱，這可能是由于力竭運(yùn)動(dòng)后機(jī)體產(chǎn)生了過(guò)量的過(guò)氧化氫，而過(guò)氧化氫能與CAT的-SH結(jié)合，從而消耗大量的CAT，破壞了細(xì)胞氧化與抗氧化的平衡。在小鼠或人體中，氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)在機(jī)體代謝中起著重要作用，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)會(huì)形成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物如MDA等，MDA是機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，同時(shí)也反映了細(xì)胞的受損程度〔17〕，力竭運(yùn)動(dòng)后，MDA含量相對(duì)有所上升，說(shuō)明機(jī)體發(fā)生了大量的過(guò)氧化反應(yīng)，這可能是因?yàn)闄C(jī)體由于自由基代謝紊亂，抗過(guò)氧化酶類(lèi)活性下降，增強(qiáng)了機(jī)體的過(guò)氧化反應(yīng)。LDH是一種糖酵解酶，存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，是機(jī)體內(nèi)無(wú)氧呼吸過(guò)程的主要酶類(lèi)，與無(wú)氧運(yùn)動(dòng)有關(guān)，耐力運(yùn)動(dòng)后，LDH活性上升，主要是因?yàn)槟土\(yùn)動(dòng)過(guò)程中進(jìn)行無(wú)氧呼吸，產(chǎn)生了大量的乳酸原因。

女貞子含有多種抗氧化活性物質(zhì)，以齊墩果酸抗氧化功能尤為顯著〔18〕，齊墩果酸是一種齊墩果烷型五環(huán)三萜類(lèi)化合物，存在于大量飲食和藥用植物中，具有抗氧化、抗感染、保護(hù)心臟、抗菌、抗病毒的藥理作用。給大鼠灌服女貞子提取物后，在進(jìn)行耐力運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中產(chǎn)生了大量的自由基，由于女貞子提取物中含有大量的抗氧化物質(zhì)，阻礙了機(jī)體發(fā)生氧化反應(yīng)，同時(shí)也可清除運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的大量自由基，維持了機(jī)體氧化與抗氧化的平衡，使得自由基代謝能夠有條不紊進(jìn)行。本研究結(jié)果顯示，女貞子提取物可維持機(jī)體自由基代謝的平衡，提高機(jī)體的抗氧化能力，提取物中的抗氧化活性物質(zhì)除了可以起到抗氧化的作用外還有許多的藥理作用，能控制人體其他的病理過(guò)程，具有比較好的保健作用。

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