電針對(duì)氯苯丙氨酸致失眠大鼠Toll樣受體/核因子-κB信號(hào)通路的影響

陳桂容　胡天俊　虞　潔　郭尚函　何揚(yáng)子

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，廣東　廣州　510632)

失眠是最常見(jiàn)的睡眠障礙，以睡眠的入睡和維持均有困難為特征的，睡眠數(shù)量或質(zhì)量不能滿足機(jī)體正常需求的一種主觀體驗(yàn)〔1〕。長(zhǎng)期失眠不利于人的身心健康，容易降低人體免疫功能，引發(fā)各個(gè)臟腑器官的功能失調(diào)，是高血壓病、糖尿病、潰瘍病、冠心病和某些精神疾病發(fā)生的高危因素。針灸以其安全有效無(wú)毒副作用的優(yōu)勢(shì)，在臨床上運(yùn)用廣泛〔2〕。Toll樣受體(TLR)/核因子(NF)-κB信號(hào)通路在免疫調(diào)節(jié)中起到了十分重要的作用。TLR/NF-κB信號(hào)通路通過(guò)誘導(dǎo)NF-κB的轉(zhuǎn)位和促進(jìn)炎癥因子如白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-α、IFN-β等的表達(dá)，發(fā)揮其在非特異性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。研究表明〔3，4〕，針灸能夠提高失眠患者的免疫功能，提高失眠大鼠IL-1、IL-2、IL-6及TNF-α的含量。有研究發(fā)現(xiàn)針灸治療失眠的機(jī)制可能與TLR的信號(hào)通路有關(guān)〔5，6〕。本實(shí)驗(yàn)探討電針治療失眠的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與分組SPF級(jí)雄性Wistar大鼠 16只，體質(zhì)量(200±20)g，由中山大學(xué)(大學(xué)城)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)學(xué)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2011-0029，NO.44008500008457。將16只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、安定組、電針組，每組4只，正常飼養(yǎng)7 d后予以相應(yīng)處理。實(shí)驗(yàn)均在8：00～17：00進(jìn)行，環(huán)境要求安靜、通風(fēng)、室溫26℃左右。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理均遵照“關(guān)于善待動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)”。

1.2主要試劑及儀器戊巴比妥鈉購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：69020100；氯苯丙氨酸(PCPA)購(gòu)自日本TCI公司，批號(hào)：H110130000；地西泮(安定)注射液購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：1401161；穗鑫牌針灸針購(gòu)自蘇州市華倫醫(yī)療用品有限公司，批號(hào)：140401； RnaEx與ddH2O購(gòu)自上海杰瑞生物工程有限公司；Quant cDNA第一鏈合成試劑盒與 SYBR Green熒光定量 PCR 試劑盒購(gòu)自天津根生化科技有限公司。KWD-808電針儀為常州市英迪電子醫(yī)療器械公司產(chǎn)品。

1.3實(shí)驗(yàn)操作PCPA按文獻(xiàn)〔7〕，臨用前把PCPA粉末用弱堿性生理鹽水配置成質(zhì)量濃度為 20 g/L懸混液。①將模型組、安定組、電針組大鼠按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45 mg/100 g體質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腹腔注射，每日1次，連續(xù)2 d。在第1次腹腔注射PCPA 28～30 h后，大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，而對(duì)照組正常，表明模型復(fù)制成功。②第3～7天模型組大鼠不予任何干涉，正常飼養(yǎng)。③安定組第3～7天進(jìn)行腹腔注射安定注射液，采用成人催眠劑量(10 mg/d)，根據(jù)人鼠給藥劑量體表面積折算公式，算得0.92 mg/kg是大鼠的給藥劑量，每日1次。④電針組大鼠第3～7天予電針神庭、百會(huì)穴治療，20 min/d，1次/d。百會(huì)、神庭穴在大鼠上的具體定位參照《常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖》，百會(huì)：大鼠頭部頂骨正中，兩耳連線中點(diǎn)；神庭：大鼠額頂骨縫交界線前方處，頭部前正中線上。電針操作：用0.25.00 mm×25 mm的無(wú)菌針斜刺進(jìn)針，3～5 mm，隨后連接上KWD-808型電針儀，選取連續(xù)波型，頻率10 Hz，電壓6 V。⑤對(duì)照組大鼠第1～7天不做任何處理，正常飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天對(duì)大鼠進(jìn)行體重檢測(cè)。

1.4標(biāo)本采集、檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠禁食過(guò)夜，用腹腔注射體積分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。無(wú)菌條件下切取其脾臟，冰上分離脂肪等雜質(zhì)，稱體質(zhì)量，脾臟迅速放入液氮冷凍，再在-80℃冰箱保存，提取RNA，取50～100 mg脾臟組織加入0.3 ml的RnaExTM試劑，使用組織搗碎機(jī)破碎細(xì)胞5～20 s(2～3次)；再將0.7 ml的RnaExTM試劑加入其中，混勻，室溫下靜置5 min。加入氯仿0.2 ml，漩渦振蕩混勻，于室溫下靜置2 min。4℃，12 000 r/min離心10 min。放置EP管時(shí)，方向必須一致。按1∶1的比例，分別各取400 μl取上清液和異丙醇置于無(wú)菌無(wú)酶的1.5 ml EP管中，充分混勻，-20℃放置20 min。4℃，12 000 r/min離心10 min，小心棄去上清。將1 ml 75%乙醇加入管中，上下倒置混勻，4℃，12 000 r/min離心5 min，小心棄去上清。再加入1 ml 75%乙醇，上下顛倒混勻，4℃，12 000 r/min離心5 min，小心棄去上清。再次4℃，12 000 r/min離心1 min，用黃槍頭吸取殘留液體，勿接觸沉淀。開(kāi)蓋晾干3 min，讓殘存的乙醇揮發(fā)殆盡，加50 μl DEPC水用手指輕彈管底溶解RNA，室溫下放置10 min。使用微量核酸分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度和純度，較好的R值應(yīng)在1.8～2.2范圍內(nèi)，取1 μg RNA 進(jìn)行按25 μl反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照RT試劑盒進(jìn)行操作。從GenBank里查找基因TLR3、TLR4、MyD88、TAB2及NF-κB序列號(hào)，引物由上海銳捷生物工程有限公司設(shè)計(jì)和合成，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。TLR3上游引物：5′-ACCTGATGACCTTCCCTCTA-3′，下游引物：5′-GCAAGTTGGCTGTATCTCGT-3′；TLR4上游引物5′-GGAGGCACATCTTCTGGA-3′，下游引物5′-GGTCATAGTTGTTGCTTCTT-3′；TAB2上游引物5′-TGAAGTGCCTGAAGTTGTT-3′，下游引物5′-TCATGTGATTGCGTAGACC-3′；MyD88上游引物5′-CGACGCCTTCATCTGCTAC-3′，下游引物5′-CCATGCGACGACACCTTT -3′；NF-κB上游引物5′-AAGCACTGTGAGGACGGC-3′，下游引物5′-CGTGAAGTATTCCCAGGTT-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-CCTAGACTTCGAGCAAGAG-3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGA-3′。PCR按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取2 μl cDNA按SYBR Green熒光定量PCR試劑盒在冰上配制PCR反應(yīng)液，將引物與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件：起始模板95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸34 s，40個(gè)循環(huán)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

實(shí)驗(yàn)中，大鼠在經(jīng)過(guò)2 d的PCPA造模后出現(xiàn)晝夜活動(dòng)不停，易受聲音、光刺激而躁動(dòng)不安，睡眠-覺(jué)醒周期紊亂，提示造模成功。經(jīng)電針和安定干預(yù)之后的大鼠則睡眠-覺(jué)醒周期得到恢復(fù)，白天安靜倦臥，逐漸恢復(fù)到正常。模型組較對(duì)照組大鼠脾臟TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)，提示大鼠失眠可能與TLR/NF-κB信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)。安定組和電針組較模型組TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)，提示電針可能是通過(guò)下調(diào)TLR/NF-κB信號(hào)通路mRNA表達(dá)，抑制IL-2、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，起到改善機(jī)體失眠的作用，見(jiàn)表1。

表1　電針對(duì)失眠模型大鼠脾臟TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-κB mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3　討　論

TLRs家族的信號(hào)傳導(dǎo)高度相似于IL-1R家族，其特點(diǎn)是依賴胞內(nèi)區(qū)的激酶和接頭蛋白分子進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。由于接頭蛋白有差異，TLRs在胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑可有2條：①M(fèi)yD88 依賴型途徑〔8〕。MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑較為經(jīng)典，TLR4是其中典型代表。在此途徑中，NF-κB通路最終被其激活從而發(fā)揮作用。TLRs與配體結(jié)合，由于MyD88羧基末端的Toll/IL受體(TIR)結(jié)構(gòu)域與結(jié)合體的二聚化其胞質(zhì)區(qū)的TIR結(jié)構(gòu)域具有同源性，會(huì)相互結(jié)合，然后活化MyD88，活化后的MyD88通過(guò)其氨基末端的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)作用于IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)氨基端，導(dǎo)致IRAK自身磷酸化。接著與TNF受體相關(guān)因子(TRAF)6發(fā)生作用，活化TRAF6與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1(TAK1)及TAK1的結(jié)合蛋白(TAB)形成復(fù)合物，NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)被激活，IκB激酶(IKKs)復(fù)合物得到磷酸化，磷酸化IKKs作用于IκB最終IκB磷酸化降解，使IκB/NF-κB復(fù)合物中釋放出NF-κB，釋放出來(lái)的NF-κB得到激活，繼而移位到細(xì)胞核內(nèi)〔9〕。 NF-κB可結(jié)合多種靶基因例如TNF和IL的啟動(dòng)子，啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄激活，這些細(xì)胞因子作為信號(hào)語(yǔ)言，最終激活機(jī)體的特異性免疫系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)免疫、細(xì)胞增殖、分化及凋亡中發(fā)揮作用。②TRIF 依賴型途徑〔8〕。TLR3、TLR4均可通過(guò)此途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)〔10〕。此途徑與 MyD88 依賴途徑大體類似，差異在于其接頭蛋白，此途徑的接頭蛋白是TIRAP或MAL，TIRAP是一種TIR包含分子，MAL是一種MyD88樣分子，最終形成TLR-TIRAP/MAL8-IRAK2 復(fù)合體〔11〕。

本實(shí)驗(yàn)表明失眠激活了TLR/NF-κB信號(hào)通路，引起炎癥因子 IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α等分泌的增加，與相關(guān)研究〔12，13〕失眠使大鼠血清細(xì)胞因子IL-6、IL-2 和TNF-α含量升高是相符的。機(jī)體感染時(shí)，體內(nèi)的免疫系統(tǒng)被激活，抵抗病原體的侵入，引起發(fā)熱和促進(jìn)睡眠，而睡眠會(huì)影響免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的活性，可見(jiàn)睡眠與免疫功能之間是相互影響的〔14，15〕。有研究發(fā)現(xiàn)睡眠不足可抑制刀豆蛋白(Con)A、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)〔16〕，失眠可引起外周血淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原刺激的增殖反應(yīng)降低，NK細(xì)胞活性降低，多形核粒細(xì)胞的吞噬功能降低，機(jī)體的免疫功能則下降。在本實(shí)驗(yàn)中，失眠激活了大鼠TLR/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，其TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB mRNA表達(dá)增強(qiáng)，其TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB分子的合成增多，促使各種細(xì)胞因子分泌增加，機(jī)體的免疫功能開(kāi)啟。TLR/NF-κB信號(hào)通路的激活一方面可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，有利于機(jī)體抵抗病原微生物的感染；另一方面其過(guò)度的激活則過(guò)度表達(dá)炎性因子，損害機(jī)體的健康，引起心肌損傷和自身免疫性疾病〔17〕，還會(huì)促進(jìn)腫瘤特別是炎癥相關(guān)腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸〔18〕。本實(shí)驗(yàn)失眠大鼠經(jīng)電針和安定干預(yù)后，其上述基因mRNA下降，各細(xì)胞因子的過(guò)度分泌得到抑制，在改善大鼠睡眠質(zhì)量的同時(shí)，其機(jī)體的免疫功能也恢復(fù)正常。

1失眠定義、診斷及藥物治療共識(shí)專家組.失眠定義、診斷及藥物治療專家共識(shí)(草案)〔J〕.中華神經(jīng)科雜志，2006；39(2)：141-3.

2劉維紅，劉濤.國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)有關(guān)針灸治療失眠癥療效的循證醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)〔J〕.上海針灸雜志，2009；28(8)：486-9.

3周艷麗，葉險(xiǎn)峰.針刺不同腧穴對(duì)失眠模型大鼠腦內(nèi)細(xì)胞因子IL-1、TNF-α 含量影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012；18(4)：419-20.

4趙倉(cāng)煥，任莉，宋媛.不同穴位處方電針對(duì)失眠大鼠下丘腦 IL-1β、TNF-α 及IL-6的影響〔J〕.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008；29(2)：177-83.

5郭尚函，趙倉(cāng)煥，林炎龍，等.耳穴貼壓對(duì)睡眠剝奪大鼠TLR4信號(hào)通路的影響〔J〕.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008；29(2)：177-83.

6何華香，趙倉(cāng)煥，陸雪，等.電針對(duì)PCPA致失眠大鼠脾臟TLR7信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響〔J〕.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015；36(2)：156-9.

7肖成榮，馬增春，李海靜，等.PCPA失眠大鼠模型的制作及其機(jī)制〔J〕.毒理學(xué)雜志，2007；21(4)：326.

8Tamai R，Asai Y，Hashimoto M，etal.Cell activation by monosaccharide lipid a analogues utilizing toll-like receptor 4〔J〕.Immunology，2003；110(1)：66-72.

9Kanarek N，Ben-Neriah Y.Regulation of NF-kappaB by ubiquitination and degradation of the IkappaBs〔J〕.Immunol Rev，2012；246(1)：77-94.

10Sasai M，Tatematsu M，Oshiumi H，etal.Direct binding ofTRAF2 and TRAF6 to TICAM- 1/TRIF adaptor participates in activation of the Toll- like receptor 3/4 pathway 〔J〕.Mol Immunol，2010；47(6)：1283-91.

11Horng T，Bart on GM，F(xiàn)lavell RA，etal.The adapt or molecule TIRAP provides signaling specificity for Toll like receptors〔J〕.Nature，2002；420(6913)：329-33.

12程少冰，張毅敏，唐純志，等.針刺對(duì)不同時(shí)段睡眠剝奪大鼠模型行為學(xué)及 TNF-α 含量的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012；32(1)：77-9.

13吳興曲，楊來(lái)啟，王曉峰，等.睡眠剝奪對(duì)大鼠血清細(xì)胞因子的影響〔J〕.中國(guó)心理衛(wèi)生雜志，2002；16(6)：377-9.

14Everson CA，Toth CA.Systemic bacterial invasion induced sleep deprivation〔J〕.Am J Physiol，2000；278(4)：905-16.

15Rogers NL，Szuba MP，Staad JP，etal.Neuroimmunologic aspects of sleep and sleep loss〔J〕.Semin Clin Neuropsychiatry，2001；6(4)：295-307.

16章茜，閻艷琴，喬鵬，等.部分睡眠剝奪對(duì)大鼠免疫功能的影響〔J〕.河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001；36(5)：559-61.

17Hedauat M，Mahmoudi MJ，Rose NR，etal.Proinflammatory cytokines in heart failure：double edged swords 〔J〕.Heart Fail Rev，2010；15(6)：543-62.

18Cheng Y，Qi X，Huang J，etal.Toll-like receptor 4 signaling promotes the immunosuppressive cytokine production of human cervical cancer 〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol，2012；33：291-4.