參松養(yǎng)心膠囊對兔心肌梗死后心肌細胞的保護作用

汪　琳　劉書芳　劉　穩(wěn)　彭　聰

(漯河市中心醫(yī)院　漯河醫(yī)專第一附屬醫(yī)院高血壓科,河南　漯河　462000)

心肌梗死是臨床上常見的心臟疾病，多數(shù)患者常常會伴有心律失常，嚴重者甚至會出現(xiàn)室顫而導致猝死。參松養(yǎng)心膠囊是由多種中藥組成的復方制劑，主要有五味子、麥冬、丹參、黃連等〔1〕。有研究發(fā)現(xiàn)，參松養(yǎng)心膠囊能夠改善心肌梗死患者的預后，降低病死率和死亡率，可以通過調(diào)控各種離子通道蛋白的表達從而保護心肌細胞〔2，3〕，而具體離子通道尚不十分明確。已有研究證實鈣離子通道在心肌梗死后的心肌細胞保護中占有重要地位〔4〕；抗心肌梗死藥物普萘洛爾可以通過恢復心肌梗死的動作電位時程等途徑保護心肌細胞〔5〕，臨床上對心肌梗死患者常常采用參松養(yǎng)心膠囊與普萘洛爾的聯(lián)合用藥方案。本研究通過建立心臟梗死的新西蘭大耳白兔動物模型，研究參松養(yǎng)心膠囊對鈣離子通道蛋白，如縫隙鏈接蛋白(Cx)43、鈉鈣交換體(NCX)及蘭尼堿受體蛋白(RyR)2表達水平的影響，探究參松養(yǎng)心膠囊對心肌梗死模型心肌細胞的可能作用機制，同時探究普萘洛爾是否具有增強參松養(yǎng)心膠囊保護心肌梗死后心肌細胞的作用。

1　材料與方法

1.1材料新西蘭大耳白兔雄性40只，體重2.5～2.8 kg，由鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。參松養(yǎng)心膠囊購自北京以嶺藥業(yè)有限公司(批號150302)，普萘洛爾購自阿斯利康制藥有限公司(批號160518)；Cx43單克隆抗體(ab11370)，NCX單克隆抗體(ab151608)，RyR2單克隆抗體(ab2868)，GAPDH(ab9485)和辣根酶標記二抗購自美國Abcam公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol Reagent購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴增試劑盒均購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2動物模型的建立及分組取新西蘭大耳白兔40只，采用隨機數(shù)字表法分為假手術對照組，梗死組，梗死+普萘洛爾組，梗死+參松養(yǎng)心膠囊組，梗死+聯(lián)合用藥組各8只。梗死組以戊巴比妥(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉后，經(jīng)前胸暴露心臟，結(jié)扎冠狀動脈左前降支。假手術對照組采取假手術，以戊巴比妥(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉后，經(jīng)前胸暴露心臟后在冠狀動脈下穿線，但不結(jié)扎。以心電監(jiān)護檢測顯示Ⅰ,Ⅱ,AVL導聯(lián)ST段抬高0.2 mV為模型建造成功的標準〔6〕。造模成功后，分別以普食(假手術對照組、梗死組)，普食+普萘洛爾粉(梗死+普萘洛爾組，普萘洛爾劑量0.5 g·kg-1·d-1)，普食+參松養(yǎng)心粉(梗死+參松養(yǎng)心膠囊組，參松養(yǎng)心膠囊原粉0.8 g·kg-1·d-1)，普食+普萘洛爾粉+參松養(yǎng)心粉(梗死+聯(lián)合用藥組，普萘洛爾劑量0.5 g·kg-1·d- 1，參松養(yǎng)心膠囊原粉0.8 g·kg-1·d-1)，喂養(yǎng)8 w后，處死動物，取心梗周圍心室組織。

1.3觀察指標

1.3.1Western印跡方法取心梗周圍心室組織，按照RIPA裂解液說明書提取組織細胞中的總蛋白。BCA法對總蛋白進行定量。取30 μg總蛋白采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白，電泳1.5 h后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Cx43單克隆抗體，稀釋比例1∶2 000)，NCX單克隆抗體(稀釋比例1∶2 000)，RyR2單克隆抗體(稀釋比例1∶2 000)，GAPDH(稀釋比例1∶3 000)，4℃過夜，PBS清洗后加入二抗(稀釋比例1∶5 000)，37℃孵育2 h，最后電化學發(fā)光顯影后用凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)測蛋白條帶光密度值。本實驗選用GAPDH作為內(nèi)參對照。分別以Cx43、NCX、RyR2與GAPDH蛋白的光密度值的比值作為Cx43、NCX、RyR2的相對表達量。

1.3.2RT-PCR方法取心肌梗死周圍心室組織，采用Trizol試劑一步法提取組織細胞中的總RNA，嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴增試劑盒說明書操作，將細胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后擴增成DNA。引物序列見表1，均由上海生物工程技術有限公司合成。RT-PCR反應條件如下： 50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，進行35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對表達量。

表1　RT-PCR引物序列

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1RT-PCR結(jié)果分析與假手術對照組相比，梗死組Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對表達水平顯著降低(t=8.485,P=0.000;t=7.483,P=0.000;t=4.234,P=0.001)；梗死+普萘洛爾組Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對表達水平與梗死組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與梗死組相比，梗死+參松養(yǎng)心膠囊組Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對表達水平均增加(t=3.081,P=0.028;t=3.922,P=0.005;t=8.832,P=0.000)；梗死+聯(lián)合用藥組Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對表達水平比梗死+參松養(yǎng)心膠囊組均顯著增加(t=2.263,P=0.043;t=2.776,P=0.025;t=2.451,P=0.039)。見表2。

2.2Western印跡結(jié)果分析與假手術對照組相比，梗死組Cx43、NCX、RyR2蛋白相對表達水平顯著降低(t=9.346,P=0.000;t=6.132,P=0.000;t=13.673,P=0.000)；梗死+普萘洛爾組Cx43、NCX、RyR2蛋白相對表達水平與梗死組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與梗死組相比，梗死+參松養(yǎng)心膠囊組的Cx43、NCX、RyR2蛋白相對表達水平增加(t=3.181,P=0.028;t=3.922,P=0.005;t=6.832,P=0.000)；梗死+聯(lián)合用藥組Cx43、NCX、RyR2蛋白相對表達水平比梗死+參松養(yǎng)心膠囊組均顯著增加(t=2.269,P=0.043;t=2.741,P=0.025;t=2.514,P=0.037)。見表3，圖1。

表2　各組心梗周圍心室組織中Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對表達水平

與假手術對照組相比：1)P<0.05；與梗死組相比：2)P<0.05；與梗死+參松養(yǎng)心膠囊組相比：3)P<0.05；下表同

表3　各組心肌梗死周圍心室組織中Cx43、NCX、RyR2蛋白相對表達水平

A：假手術對照組；B：梗死組；C：梗死+普萘洛爾組；D：梗死+參松養(yǎng)心膠囊組；E：梗死+聯(lián)合用藥組圖1　各組心肌梗死周圍心室組織中Cx43、NCX、RyR2蛋白表達

3　討　論

心肌梗死是冠狀動脈堵塞導致的部分心肌缺血性壞死，在我國，心肌梗死的發(fā)病率迅速上升，并且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢〔7〕。心肌梗死的發(fā)病環(huán)節(jié)主要有微血管損傷、氧自由基的產(chǎn)生及細胞內(nèi)鈣超載等。目前臨床上，有針對心肌梗死各發(fā)病環(huán)節(jié)的治療藥物，然而心肌梗死患者的預后仍不十分樂觀，急需尋求更加有效的治療心肌梗死或降低心肌梗死后心肌細胞損傷的治療藥物或治療方案。

細胞內(nèi)鈣超載是導致心肌梗死后發(fā)生心律失常，最終導致患者不良預后的重要因素之一。鈣超載能夠通過縮短動作電位時程，誘發(fā)短暫后除極，最終導致缺血性心律失常的發(fā)生。Zhang等〔8〕研究證實，抑制鈣超載可以降低心肌梗死后發(fā)生心律失常的發(fā)生率。Cx43、NCX、RyR2基因編碼相應的鈣離子通道蛋白Cx43、NCX、RyR2，參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的鈣離子平衡，心肌細胞內(nèi)Cx43、NCX、RyR2的表達水平能夠反映細胞的鈣超載情況。Cx43是心室肌細胞間縫隙連接(GJ)通道的重要成員，同時也是心室肌細胞間電流傳導的主要導體〔9〕。Yuan等〔10〕研究證實，Cx43是冠狀動脈阻塞后心肌梗死范圍大小的最主要的決定因素之一。NCX參與維持細胞內(nèi)鈣離子平衡，在缺血缺氧等病理條件下，NCX引起細胞內(nèi)鈣超載，從而誘發(fā)細胞凋亡〔11〕。RyR2是心肌肌漿網(wǎng)中的鈣通道，有研究證實，心肌梗死患者的心肌細胞中RyR2表達下降，功能抑制，導致心肌收縮能力下降〔12〕。本研究結(jié)果表明普萘洛爾不參與心肌細胞的鈣離子通道蛋白的調(diào)節(jié)，而參松養(yǎng)心膠囊能夠通過調(diào)節(jié)心肌細胞的鈣離子通道蛋白從而保護心肌梗死的心肌細胞；采用參松養(yǎng)心膠囊與普萘洛爾聯(lián)合用藥后，普萘洛爾能夠增強參松養(yǎng)心膠囊保護心肌梗死后心肌細胞的作用。

綜上所述，心肌梗死后的心肌細胞中，鈣離子通道蛋白Cx43、NCX、RyR2表達下降，參松養(yǎng)心膠囊部分逆轉(zhuǎn)Cx43、NCX、RyR2表達水平，減輕鈣超載對心肌細胞的損害，保護心肌細胞，改善心功能；普萘洛爾能夠增強參松養(yǎng)心膠囊對心肌梗死后心肌細胞的保護作用，內(nèi)在的具體作用機制尚不明確，將在以后的研究中深入探討。

1向家培,趙勁波,王勇,等.參松養(yǎng)心膠囊對心肌梗死模型小鼠心臟重構(gòu)的影響〔J〕.醫(yī)藥導報,2016;35(6):588-91,592.

2劉自強,王晞,黨松.參松養(yǎng)心膠囊對心梗后心肌的保護作用及機制研究〔J〕.海南醫(yī)學,2015;26(24):3589-92.

3馬柳一,尹玉潔,劉煥,等.參松養(yǎng)心膠囊治療心律失常藥理學機制研究概況〔J〕.中醫(yī)雜志,2016;57(9):794-7.

4Hassan MQ,Akhtar MS,Akhtar M,etal.Edaravone,a potent free radical scavenger and a calcium channel blocker attenuate isoproterenol induced myocardial infarction by suppressing oxidative stress,apoptotic signaling and ultrastructural damage〔J〕.Ther Adv Cardiovasc Dis,2016;10(4):214-23.

5劉家軍,李小燕,杜成芬,等.丹參酮ⅡA磺酸鈉對急性心肌梗死大鼠心肌組織間液鈣離子與心功能的影響〔J〕.安徽醫(yī)藥,2016;20(4):643-6.

6來欣,王晞,黨松,等.胺碘酮聯(lián)合阿托伐他汀對兔心肌梗死模型心臟MAPD90、VFT的影響〔J〕.山東醫(yī)藥,2015;55(16):24-5.

7Li Y,Wang D,Hu C,etal.Efficacy and safety of adjunctive trimetazidine therapy for acute myocardial infarction:a systematic review and meta-analysis〔J〕.Cardiology,2016;135(3):188-95.

8Zhang XD,Lieu DK,Chiamvimonvat N.Small-conductance Ca2+-activated K+channels and cardiac arrhythmias〔J〕.Heart Rhythm,2015;12(8):1845-51.

9Hawat G,Hélie P,Baroudi G.Single intravenous low-dose injections of connexin 43 mimetic peptides protect ischemic heart in vivo against myocardial infarction〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2012;53(4):559-66.

10Yuan MJ,Huang H,Tang YH,etal．Effects of ghrelin on Cx43 regulation and electrical remodeling after myocardial infarction in rats〔J〕.Peptides,2011;32(11):2357-61.

11Almagor L,Giladi M,van Dijk L,etal．Functional asymmetry of bidirectional Ca2+-movements in an archaeal sodium-calcium exchanger(NCX_Mj)〔J〕.Cell Calcium,2014;56(4):276-84.

12Houser SR.Role of RyR2 phosphorylation in heart failure and arrhythmias:protein kinase A-mediated hyperphosphorylation of the ryanodine receptor at serine 2808 does not alter cardiac contractility or cause heart failure and arrhythmias〔J〕.Circ Res,2014;114(8):1320-7.