N-乙酰半胱氨酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的保護(hù)作用

王凌霄　王阿磊　丁　菁　張　倩　黃　華　姜君財(cái)　陸德琴

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴州　貴陽(yáng)　550025)

內(nèi)皮功能障礙(ED)是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的共同始動(dòng)因素，氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致ED的主要原因之一〔1〕。生理情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一氧化氮(NO)在維持血管穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用，NO在一氧化氮合酶(NOS)的催化下產(chǎn)生，主要來(lái)源于內(nèi)皮型NOS(eNOS)。ED的重要表現(xiàn)之一是eNOS/NO功能受損，其機(jī)制可能與eNOS活性下降及NO生物利用度降低有關(guān)。蛋白磷酸酶(PP)2A是目前已知還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶(Nox)源性活性氧(ROS)的主要靶蛋白之一，也是使eNOS Ser1177/1179去磷酸化的主要磷酸酶〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為一種ROS清除劑可以減輕氧化應(yīng)激，對(duì)血管形態(tài)及功能起到保護(hù)作用〔3〕。血管緊張素(Ang)Ⅱ可通過(guò)多種途徑產(chǎn)生大量的ROS，從而造成ED〔4〕。本研究對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)給予AngⅡ刺激，同時(shí)使用NAC對(duì)HUVECs進(jìn)行預(yù)處理，初步探討NAC預(yù)處理對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性的保護(hù)作用及機(jī)制。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器HUVECs由貴州醫(yī)科大學(xué)曾柱教授惠贈(zèng)；胎牛血清(FBS)、無(wú)酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；高糖DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶(HyClone)；NAC、AngⅡ(Sigma)；聚氟偏乙烯(PVDF)蛋白雜交膜(Millipore)；電化學(xué)發(fā)光法(ECL)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Bio-Rad)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(Thermo)；鼠抗人eNOS抗體(BD)；兔抗鼠eNOS Ser1177抗體(Millipore)；兔抗鼠PP2A-c Y307抗體(Abcam)；兔抗鼠PP2A-Cα抗體、羊抗兔I2PP2A抗體、兔抗鼠β-tubulin抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗、羊抗鼠Ⅱ抗、兔抗羊Ⅱ抗(Santa Cruz)；兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體、兔抗人CD34抗體(北京博奧森生物公司)；鏈霉親合素-生物素復(fù)合物(SABC)法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋公司)；BX41顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)；ROS檢測(cè)試劑盒(碧云天)；NOS分型測(cè)定及NO測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)HUVECs接種于無(wú)菌25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37℃、5 %CO2的培養(yǎng)箱中用含10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每48 h更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)取4～10代的細(xì)胞。

1.3細(xì)胞鑒定細(xì)胞爬片后，于六孔板中培養(yǎng)。待密度至50%左右時(shí)，用無(wú)FBS培養(yǎng)基靜止12 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，采用4%多聚甲醛固定，用兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體和兔抗人CD34抗體作為Ⅰ抗，1∶100稀釋后，SABC法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。PBS培養(yǎng)作為陰性對(duì)照。鏡下胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。200倍顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞率(%)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4分組

1.4.1單純AngⅡ處理實(shí)驗(yàn)HUVECs隨機(jī)分為正常對(duì)照組和AngⅡ組(AngⅡ濃度分別為1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L，處理12 h)。通過(guò)Western印跡檢測(cè)eNOS Ser1177磷酸化水平，AngⅡ最終使用濃度取1×10-7mol/L和1×10-6mol/L，處理時(shí)間12 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2NAC預(yù)處理實(shí)驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)〔5〕，采用終濃度為1×10-3mol/L的NAC預(yù)處理1 h，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、AngⅡ(1×10-7mol/L和1×10-6mol/L，處理12 h)組、單純NAC組、NAC(預(yù)處理)+AngⅡ(1×10-7mol/L、1×10-6mol/L)組。

1.5細(xì)胞內(nèi)ROS的測(cè)定于六孔板中培養(yǎng)HUVECs，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和AngⅡ組，作用12 h后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1.5 ml終濃度為10 μmol/L的熒光探針二氯熒光磺雙乙酸鹽(DCFH-DA，使用無(wú)FBS培養(yǎng)基稀釋)，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無(wú)FBS培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)于倒置熒光顯微鏡觀察熒光并拍照，采用Image J軟件分析DCF的熒光強(qiáng)度。

1.6Western印跡檢測(cè)蛋白水平分別收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰上刮取細(xì)胞后裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，其余蛋白變性后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，上樣，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜后孵育Ⅰ抗4℃過(guò)夜。次日TBST洗膜后，加入Ⅱ抗，常溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影曝光。用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)軟件分析蛋白條帶相對(duì)積分吸光度值。

1.7化學(xué)比色法檢測(cè)HUVECs中細(xì)胞組成型一氧化氮合酶(cNOS)活性細(xì)胞處理完畢后使用0.25%胰蛋白酶消化，采用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，重懸，1 000 r/min離心5 min，得細(xì)胞沉淀。加入適量PBS洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心6 min，棄上清，重復(fù)洗滌2次。在細(xì)胞沉淀中加入300 μl的PBS，混勻，超聲粉碎細(xì)胞，取上清進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定和cNOS檢測(cè)。所有檢測(cè)均復(fù)6孔。

1.8化學(xué)比色法檢測(cè)HUVECs培養(yǎng)基中NO含量細(xì)胞處理完畢后分別對(duì)應(yīng)收集各組培養(yǎng)基，按試劑盒說(shuō)明書(shū)添加試劑一和二，混勻后于酶標(biāo)儀550 nm波長(zhǎng)處測(cè)各組A值。所有檢測(cè)均復(fù)6孔。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料樣本均數(shù)比較前先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間兩兩比較采用SNK-q法。

2　結(jié)　果

2.1細(xì)胞鑒定結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的HUVECs中，Ⅷ因子相關(guān)抗原和CD34表達(dá)陽(yáng)性，陰性對(duì)照組未見(jiàn)胞質(zhì)黃染，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率為100%。見(jiàn)圖1。

A：Ⅷ因子相關(guān)抗原陰性對(duì)照；B：HUVECs中Ⅷ因子相關(guān)抗原陽(yáng)性表達(dá)；C：CD34陰性對(duì)照；D：HUVECs中CD34陽(yáng)性表達(dá)圖1?、蜃酉嚓P(guān)抗原和CD34在HUVECs中的表達(dá)(SABC,×200)

2.2AngⅡ刺激HUVECs后下調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平各劑量AngⅡ刺激HUVECs 12 h后，與正常對(duì)照組比較及各組間eNOS蛋白表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各劑量AngⅡ組eNOS Ser1177磷酸化水平均明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)，AngⅡ各組間eNOS Ser1177磷酸化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

1:正常對(duì)照組；2:AngⅡ10-9mol/L組；3:AngⅡ10-8mol/L組；4:AngⅡ10-7mol/L組；5:AngⅡ10-6mol/L組；6:AngⅡ10-5mol/L組;與正常對(duì)照組相比:1)P<0.05圖2　AngⅡ刺激HUVECs 12 h后各組eNOS蛋白表達(dá)及eNOS Ser1177磷酸化水平的變化

2.3AngⅡ刺激HUVECs后增加ROS的產(chǎn)生AngⅡ(1×10-7mol/L、1×10-6mol/L)刺激HUVECs 12 h后，DCF熒光強(qiáng)度與正常對(duì)照組比較明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05圖3　AngⅡ刺激HUVECs 12 h后細(xì)胞中DCF的熒光強(qiáng)度(×200)

2.4NAC預(yù)處理增加eNOS Ser1177磷酸化水平各組間eNOS蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AngⅡ10-7mol/L組、AngⅡ10-6mol/L組與正常對(duì)照組比較eNOS Ser1177磷酸化水平明顯降低(P<0.05)；與同濃度AngⅡ組比較，NAC預(yù)處理后eNOS蛋白表達(dá)差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，eNOS Ser1177磷酸化水平明顯增加(P<0.05)。AngⅡ各濃度組間、NAC預(yù)處理+AngⅡ各濃度組間比較，上述指標(biāo)變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

1:正常對(duì)照組；2：AngⅡ10-7mol/L組；3:AngⅡ10-6mol/L組；4:NAC組；5：NAC+AngⅡ10-7mol/L組；6：NAC+AngⅡ10-6mol/L；與正常對(duì)照組比較，1)P<0.05；與AngⅡ10-7mol/L組組比較，2)P<0.05；與AngⅡ10-6mol/L組比較，3)P<0.05；下圖、下表同圖4　NAC預(yù)處理對(duì)AngⅡ刺激HUVECs后各組eNOS蛋白表達(dá)及eNOS Ser1177磷酸化水平的影響

2.5NAC預(yù)處理增加PP2A-c Y307磷酸化水平和I2PP2A蛋白表達(dá)水平AngⅡ刺激后PP2A-Cα蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PP2A-c Y307磷酸化水平、I2PP2A蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與同濃度AngⅡ組比較，NAC預(yù)處理后PP2A-Cα蛋白表達(dá)差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PP2A-c Y307磷酸化水平、I2PP2A蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。各濃度AngⅡ組間、NAC+AngⅡ各濃度組間比較上述指標(biāo)變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5　NAC預(yù)處理對(duì)AngⅡ刺激HUVECs后各組PP2A-Cα、I2PP2A蛋白表達(dá)和PP2A-c Y307磷酸化水平的影響

2.6NAC預(yù)處理增加細(xì)胞cNOS活性及培養(yǎng)基中NO的含量AngⅡ刺激后，cNOS活性、培養(yǎng)基中NO含量均明顯降低(P<0.05)；與同濃度AngⅡ組比較，NAC預(yù)處理后cNOS活性、培養(yǎng)基中NO含量均明顯增加(P<0.05)。AngⅡ各濃度組間、NAC+AngⅡ各濃度組間比較，cNOS活性、NO含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組cNOS活性和培養(yǎng)基中NO含量的變化

3　討　論

氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，ROS產(chǎn)生增多，可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。因此，減少氧化應(yīng)激，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，已經(jīng)成為防治心血管疾病的研究熱點(diǎn)。

eNOS活性調(diào)控的機(jī)制之一是其多個(gè)絲/蘇氨酸位點(diǎn)的磷酸化，其中eNOS Ser1177/1179磷酸化上調(diào)可使eNOS活性增強(qiáng)，NO產(chǎn)生增多〔6〕。cNOS包括神經(jīng)元型NOS(nNOS)和eNOS，因此cNOS活性本應(yīng)是兩者活性之和。但研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞主要以eNOS表達(dá)為主〔7〕，且本課題組前期使用免疫組化的方法證實(shí)nNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)很低〔8〕，故本研究中測(cè)定的cNOS活性可以代表eNOS活性。

AngⅡ刺激后可產(chǎn)生大量ROS，通過(guò)抑制蛋白激酶B(Akt)/eNOS信號(hào)途徑，從而下調(diào)eNOS 1177磷酸化水平，造成血管內(nèi)皮功能障礙〔9〕。本研究結(jié)果提示AngⅡ刺激可產(chǎn)生大量的ROS，eNOS Ser1177磷酸化水平下調(diào)，從而發(fā)生內(nèi)皮功能紊亂。研究表明Akt可以上調(diào)eNOS Ser1177/1179磷酸化水平〔10〕；且有報(bào)道PP2A是Nox源性ROS的靶蛋白之一，而PP2A可使Akt、eNOS Ser1177〔2〕發(fā)生去磷酸化。PP2A是一種絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，可使蛋白質(zhì)脫磷酸，在PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路中起負(fù)性調(diào)控作用〔11〕。PP2Ac高度保守C端尾巴可發(fā)生翻譯后磷酸化和甲基化修飾，磷酸化可發(fā)生在Tyr307上，抑制PP2A酶活性〔12〕。PP2A包括I1PP2A和I2PP2A兩種胞內(nèi)具有特異性、非競(jìng)爭(zhēng)性和熱穩(wěn)定性的抑制蛋白〔13〕。Li等〔14〕從牛腎抽提物中純化出I2PP2A蛋白，能顯著抑制PP2A的活性。因此本研究主要檢測(cè)PP2A-c Y307磷酸化水平和I2PP2A蛋白表達(dá)水平，作為對(duì)PP2A活性的判斷。結(jié)果顯示，AngⅡ刺激產(chǎn)生了大量的ROS，可能通過(guò)下調(diào)PP2A-c Y307和I2PP2A水平激活PP2A，PP2A可間接通過(guò)Akt去磷酸化或直接作用從而下調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平，降低eNOS活性及培養(yǎng)基中NO含量，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能受損。

NAC是含巰基的谷胱甘肽(GSH)的前體，作為一種ROS清除劑，具有清除氧自由基的作用，可以改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，在HUVECs中使用NAC可清除ROS，通過(guò)激活A(yù)kt/eNOS信號(hào)通路，從而上調(diào)eNOS 1177磷酸化水平〔15〕。本研究結(jié)果顯示，NAC預(yù)處理可能通過(guò)清除ROS，激活A(yù)kt/eNOS信號(hào)通路，從而發(fā)揮保護(hù)eNOS活性的作用。有研究報(bào)道，在人類前列腺細(xì)胞株DU145中使用NAC清除ROS后，可抑制PP2A活性，進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)通路〔16〕。在研究成纖維細(xì)胞自噬過(guò)程中，使用NAC清除ROS后可通過(guò)抑制半胱氨酸殘基的亞磺?；饔?，從而降低PP2A活性，且此過(guò)程中檢測(cè)到PP2A-c Y307磷酸化水平增加〔17〕。本研究結(jié)果顯示，NAC預(yù)處理可能通過(guò)減少ROS生成，上調(diào)PP2A-c Y307和I2PP2A使PP2A活性降低，從而上調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平，增加eNOS活性，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

綜上，AngⅡ可能通過(guò)降低PP2A-c Y307和I2PP2A使PP2A活性增加，最終導(dǎo)致eNOS活性降低；NAC預(yù)處理可通過(guò)增加PP2A-c Y307和I2PP2A，從而降低PP2A活性，發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性的作用。

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