替米沙坦對4%高鹽飲食誘導(dǎo)腎臟纖維化的保護作用

趙　宇　劉　燕　商黔惠　王曉春　劉　嬋　劉　娟

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所　心血管病研究所　高血壓研究室，貴州　遵義　563003)

原發(fā)性高血壓是由多種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的疾病，鹽作為一種重要的環(huán)境因素，在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔1〕。研究表明，腎臟和鹽敏感性有著密切關(guān)系,腎臟纖維化是高鹽飲食引起腎臟損害的重要病理表現(xiàn)，而轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smads信號通路是腎臟纖維化發(fā)生過程中最重要的信號通路〔2〕。TGF-β信號系統(tǒng)參與多種慢性腎臟損傷的病理生理過程，主要包括促進細胞外基質(zhì)集聚、誘導(dǎo)足細胞凋亡和腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化等〔3〕。替米沙坦能明顯降低血壓、改善高血壓腎損害，但其機制尚不明確。本實驗研究替米沙坦對高鹽誘導(dǎo)腎臟損害的保護作用及抗纖維化的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組4周齡清潔級雄性Wistar大鼠36只，均購于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心，許可證號：SCXK-(渝)2007-0005。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機分為3組：普食組 12只：予0.5%NaCl的顆粒飼料喂養(yǎng)；高鹽組 12只：予4%NaCl的顆粒飼料喂養(yǎng)；高鹽+替米沙坦組12只：予4%NaCl的顆粒飼料喂養(yǎng)+替米沙坦40 mg·kg-1·d-1灌胃。動物室溫度22℃～25℃，濕度45%左右。晝夜交替12 h，大鼠自由飲水，每天更換一次墊料，保持墊料干燥。實驗每4 w用Softron BP-98A大小鼠無創(chuàng)測壓儀進行尾動脈收縮壓的測定。

1.2主要試劑含NaCl 分別為0.5%和4%的顆粒飼料，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,許可證號：SCXK-(粵)2008-0002。替米沙坦原料(上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司)，小鼠抗β-actin單克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，兔抗TGF-β1多克隆抗體、山羊抗Smad2/3多克隆抗體、小鼠抗Smad7 多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.324 h尿液的收集實驗第24周，將各組大鼠分別用代謝籠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，收集24 h尿液，用尿生化儀檢測尿微量白蛋白(MAU)、尿肌酐(Cr)。

1.4標本收集24 w實驗?zāi)?，將各組大鼠稱重，10%水合氯醛40 mg/kg麻醉，從頸動脈插管采血，加入血生化管中，將生化管放入半徑15 cm離心機中4 000 r/min離心10 min，-80℃冰箱保存待測。取出兩側(cè)腎臟置冰盒上，投入冰冷的生理鹽水中清洗，去除脂肪及被膜組織，置濾紙上吸干后放電子天平上稱重。將右腎橫切為兩半，取上極分離皮質(zhì)，將中間厚度約0.3 cm的組織塊在4%多聚甲醛緩沖液中固定24 h，石蠟包埋，切片，用做蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色，其余腎臟組織分離出腎皮質(zhì)-80℃冰箱保存。

1.5HE染色檢測腎臟形態(tài)學(xué)變化制備各組腎皮質(zhì)蠟塊切片，厚度約10 μm，常規(guī)脫蠟、水化，滴加蘇木素染色4 min，返藍沖洗后滴加伊紅染色2 min，酒精脫水、烘干后中性樹膠封片。用Leica光學(xué)顯微鏡在400倍下觀察腎臟腎小球、腎小管等形態(tài)學(xué)改變。

1.6Masson染色檢測腎臟纖維化程度制備各組腎皮質(zhì)蠟塊切片，厚度約10 μm，常規(guī)脫蠟、水化，現(xiàn)配蘇木素染液3 min，返藍沖洗后滴加1%麗春紅酸性復(fù)紅液30 min后，清洗后滴加1%磷鉬酸數(shù)秒，清洗后滴加2%亮綠2～3 min，清洗烘干后中性樹膠封片。采用Leica圖像分析儀進行半定量分析:在同一條件下對每張標本選取6個不重復(fù)的腎小球視野(×400)，將腎小球內(nèi)呈現(xiàn)為綠色的纖維區(qū)域視作陽性目標，以陽性面積與腎小球總面積的比值作為腎小球纖維化指數(shù)。

1.7各蛋白表達的檢測將各組大鼠腎皮質(zhì)用蛋白提取試劑盒提取蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉1.5 h，然后加入一抗(1∶1 000 α-SMA 、TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)4℃孵育過夜，然后加入二抗(1∶2 000相應(yīng)二抗)孵育1 h,洗膜后顯影。使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的光密度值比值表示其相對表達量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件，正態(tài)分布資料組間比較采用單因素方差分析,方差齊使用LSD法,方差不齊使用Tamhane T2法。

2　結(jié)　果

2.1各組尾動脈收縮壓的變化從第8周起，高鹽組及高鹽+替米沙坦組尾動脈收縮壓顯著高于普食組(P<0.05)，與高鹽組比較，高鹽+替米沙坦組大鼠尾動脈收縮壓顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1　各組尾動脈收縮壓的變化

與普食組相比:1)P<0.05;與高鹽組相比:2)P<0.05，下表同

2.2各組腎臟生化指標比較與普食組相比，高鹽組及高鹽+替米沙坦組雙腎重量/體重、尿MAU均明顯增加(均P<0.05)，Ccr顯著降低(P<0.05)；替米沙坦組尿MAU較高鹽組顯著下降(P<0.05)，但雙腎重/體重及Ccr與高鹽組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2　各組腎臟生化指標的變化

2.3各組腎皮質(zhì)HE染色結(jié)果與普食組相比，高鹽組腎小球硬化、腎小管肥大，而替米沙坦組能明顯改善腎小球硬化。見圖1。

2.4各組腎皮質(zhì)Masson染色結(jié)果及腎小球纖維指數(shù)比較與普食組相比，高鹽組腎小球膠原纖維明顯增加，替米沙坦組與高鹽組比較腎小球膠原纖維明顯減少。進一步計算腎小球纖維化指數(shù)，高鹽組腎小球纖維纖化指數(shù)較普食組明顯增加〔(20.93±1.14) vs (13.55±1.13)，P<0.05〕，替米沙坦組(13.83±1.19)較高鹽組明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖1　各組腎皮質(zhì)HE染色結(jié)果(×400)

圖2　各組腎皮質(zhì)Masson染色結(jié)果(×400)

2.5各組腎皮質(zhì)TGF-β1/Smads通路蛋白表達的變化與普食組相比，高鹽組及高鹽+替米沙坦組腎皮質(zhì)α-SMA、TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白表達均明顯增加(均P<0.05)，替米沙坦組較高鹽組明顯降低(均P<0.05)。見表3，圖3。

表3　各組腎皮質(zhì)TGF-β1/Smads通路蛋白表達的變化

圖3　各組腎皮質(zhì)TGF-β1/Smads通路蛋白表達的變化

3　討　論

長期高鹽飲食是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)境因素之一，但高鹽飲食對靶器官損害的機制目前仍不清楚。本實驗從第8周開始高鹽組大鼠血壓逐漸升高，并持續(xù)至實驗?zāi)?。說明長期高鹽飲食可導(dǎo)致Wistar大鼠血壓升高，與文獻結(jié)果一致〔4〕。本文觀察到，高鹽飲食的攝入對腎小球有損傷，這與已有的報道一致〔5〕。本研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦能明顯降低高鹽飲食引起的血壓增高，降低尿微量白蛋白，提示替米沙坦能降低血壓和減少蛋白排泄。因此，替米沙坦除了能降低血壓外，對腎臟的保護作用值得進一步研究。

腎臟纖維化是慢性腎臟病變重要的病理表現(xiàn)。腎臟纖維化是一個多因素參與的復(fù)雜過程，主要包括TGF、細胞分泌因子、氧化應(yīng)激、炎癥刺激等。研究證實〔6〕,TGF-β1是促進腎臟纖維化的最關(guān)鍵因子。TGF-β1 與TGF-β1Ⅱ型受體結(jié)合后,激活TGF-β1Ⅰ型受體的絲氨酸-蘇氨酸激酶,Smad2、Smad3蛋白被磷酸化,進一步與Smad4形成活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進入核內(nèi),調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄〔6〕。高鹽可引起自發(fā)性高血壓大鼠與Wistar-Kyoto大鼠腎臟TGF-β1基因過量表達，從而導(dǎo)致腎小球、腎小管廣泛纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞、內(nèi)皮細胞、足細胞及腎小球上皮細胞均可以發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，參與腎臟纖維化的形成〔6〕。在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中，腎小管上皮細胞可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,而α-SMA是肌成纖維細胞的特征蛋白，α-SMA陽性的肌成纖維細胞是主要的基質(zhì)合成細胞〔7〕。進一步相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，給予Dahl鹽敏感大鼠TGF-β1抗體治療后，腎臟TGF-β1 mRNA 及蛋白的表達下調(diào)，可降低高鹽飲食引起的血壓升高及改善心臟、腎臟等靶器官功能障礙〔8〕，說明抑制TGF-β1可減輕高鹽引起的腎小球和腎小管細胞損傷。Smad7是TGF-β1信號通路的負反饋調(diào)節(jié)因子,主要通過與TGF-β1Ⅰ型受體結(jié)合抑制TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)〔9〕。研究表明，過量表達的Smad7可通過阻斷活化的Smad2、3抑制α-SMA的表達，從而發(fā)揮了逆轉(zhuǎn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制腎臟纖維化形成的作用〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦可通過激活過氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)-γ抑制肝臟纖維化〔11〕。替米沙坦可通過抑制巨噬細胞的浸潤，降低單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠HIF-1α的表達，減輕單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠腎臟纖維化〔12〕。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦通過抑制TGF-β1/Smads通路減輕長期高鹽飲食誘導(dǎo)Wistar大鼠血壓升高及心肌纖維化〔13〕，同時，替米沙坦可改善長期高鹽飲食誘導(dǎo)Wistar大鼠腎臟功能損害和保護腎小球損害〔14〕，但其機制尚不明確。本實驗發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/smads通路在高鹽誘導(dǎo)的腎臟纖維化進程中起著重要的作用，而Smad7代償性增高不能阻斷腎臟纖維化的發(fā)生。本研究提示替米沙坦能明顯改善腎小球纖維化，可能通過抑制TGF-β1/smads通路有關(guān)。

綜上所述，TGF-β1/smads通路參與高鹽誘導(dǎo)的腎臟纖維化進程，替米沙坦可能通過抑制TGF-β1/smads通路改善腎臟纖維化，從而改善高鹽誘導(dǎo)高血壓所致的腎損害。

1Franco V,Oparil S.Salt sensitivity,a determinant of blood pressure,cardiovascular disease and survival〔J〕.J Am Coll Nutr,2006;25(3 Suppl):247S.

2Susica D,Frohlicha ED,Koborib H,etal.Salt-induce renal in SHRs is mediated by AT1 receptor activation〔J〕.J Hypertens,2011;29(4):716-23.

3Schiffer M,Bitzer M,Roberts IS,etal.Apotosis in podocytes induced by TGF-β and smad7〔J〕.Clin Invest,2001;108(6):807-16.

4于海榮,范洪亮,梅愛敏,等.不同濃度高鹽飼料喂養(yǎng)致高血壓模型的實驗研究〔J〕.山東醫(yī)藥,2012;52(32):34-6.

5Habibi J,Hayden MR,Ferrario CM,etal.Sait loading promotes kidney injury via fibrosis in youny female Ren2 rats〔J〕.Cardiorenal Med,2014;4(1):43-52.

6謝盛彬,王偉銘,陳楠.UUO模型大鼠腎間質(zhì)纖維化動態(tài)進展及α-SMA、TGF-β1和VDR表達變化〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010;30(7):752-7.

7Qi W,Chen X,Poronnik P,etal.The renal cortical fibroblast in renal tubulointerstitial fibrosis〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2006;38(1):1-5．

8Dahly AJ,Hoagland KM,Flasch AK,etal.Antihypertensive effects of chronic anti-TGF-beta antibody therapy in Dahl S rats〔J〕.Am Regul Integr Comp Physiol,2002;283(3):R757-67.

9王琳,鄧躍毅,陳以平.Smad7對TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)及其在腎纖維化中的作用〔J〕.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2004；25(2):207-9.

10Ka SM,Huang XR,Lan HY,etal.Smad7 gene therapy ameliorates an autoimmune crescentic glomerulonephritis in mice〔J〕.J Am Soc Nephrol,2007;18(6):1777-88.

11李國云,傅茂英,孟麗萍,等.替米沙坦對肝纖維化大鼠肝組織TGFβ1、PDGF和PPAR-γ表達的影響〔J〕.實用肝臟病雜志,2012;15(6):520-3.

12廖盼麗.替米沙坦通過影響HIF-1α的表達抑制腎臟纖維化的進展〔D〕.武漢：華中科技大學(xué),2012.

13李同,商黔惠,劉嬋,石耿輝.轉(zhuǎn)化生長因子β_1/Smads表達在高鹽飲食致Wistar大鼠心肌纖維化中的作用及替米沙坦干預(yù)〔J〕.中華高血壓雜志,2013;(7):648-53.

14王曉春,商黔惠,等.高鹽誘導(dǎo)Wistar大鼠腎損害的機制及替米沙坦的干預(yù)效果〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2015;35(12):3213-5.