山茶籽醇提物對(duì)去卵巢AD大鼠學(xué)習(xí)記憶、腦組織p-tau蛋白的影響

李　海　解繼勝　楊　潔　黃月妹　黎　飚

(右江民族醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室,廣西　百色　533000)

腦組織p-tau蛋白增多引起神經(jīng)纖維纏結(jié)、β樣淀粉蛋白(Aβ)在腦組織沉積引起大腦中樞的組織損害，在皮下組織Aβ沉積，引起皮膚老年斑，這些病變是阿爾茨海默病(AD)的病理基礎(chǔ)〔1～3〕。本文主要探討山茶籽醇提物對(duì)去卵巢AD大鼠學(xué)習(xí)記憶、腦組織p-tau蛋白的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用5月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量為(350±20)g，為右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心所提供。大鼠均在(25±2)℃、燈光12 h進(jìn)行交替，相對(duì)的濕度為56%條件規(guī)范喂養(yǎng)。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、山茶籽組、雌二醇(E2)組各10只。

1.2模型建立30只大鼠用濃度為10 g/L 的戊巴比妥鈉水溶液進(jìn)行腹腔注射(3.0 mg/kg)，檢查大鼠麻醉適度后，經(jīng)腰背部雙切口入腹腔，切除卵巢，切口逐層縫合。所切除物均經(jīng)過組織學(xué)切片觀察確認(rèn)。切除卵巢后用硫酸慶大霉素肌注3 d，預(yù)防切口感染，并持續(xù)3 d。去卵巢1 w后，用濃度為10 g/L的戊巴比妥鈉水溶液進(jìn)行腹腔注射(麻醉劑量為3.0 mg/kg)。將大鼠固定在大鼠專業(yè)腦立體定位儀器上，使大鼠前囟暴露于正中切口，把前囟作為原點(diǎn)，向后4.3 mm、旁開2.1 mm為進(jìn)針點(diǎn)進(jìn)行顱骨鉆孔。從大腦表面緩慢進(jìn)針達(dá)3.1 mm到達(dá)雙側(cè)海馬處，緩慢注入Aβ25～35 1 μl(10 μg，使用微量注射器)，并且留針5 min，確保海馬區(qū)局部?jī)?nèi)的組織被注射物浸潤(rùn)充分。造模術(shù)后用硫酸慶大霉素肌肉注射避免感染。在顱內(nèi)注射Aβ25～35結(jié)束3 d之后，使用100 mg/kg D-半乳糖并用0.9%生理鹽水注射液溶解、稀釋至2 ml再進(jìn)行腹腔注射，1次/d，持續(xù)14 d。假手術(shù)組：與模型組手術(shù)過程相同，只切去卵巢旁邊的一小塊脂肪，保留卵巢，和AD大鼠模型組同樣開顱鉆孔用等容量0.9%鹽水注射海馬局部。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥山茶籽組：用山茶籽榨油后的殘余物(茶麩)的醇提物進(jìn)行灌胃，10 ml·kg-1·d-1(5 g生藥/g)；E2組：用E2進(jìn)行皮下注射，按200 μg/kg，2次/w；模型組和假手術(shù)組給予等體積的0.9%生理鹽水進(jìn)行灌胃，10 ml/kg，1次/d。

1.4Y型水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)各組大鼠8 w實(shí)驗(yàn)后的學(xué)、記能力測(cè)試。在水迷宮水池的中央放置一個(gè)水深1.5 cm處的平臺(tái)，測(cè)試各組大鼠空間方位學(xué)習(xí)及空間方位記憶能力。

1.5免疫組化法檢測(cè)腦組織p-tau蛋白含量水平①心臟灌注并取腦，用10 g/L濃度的異戊巴比妥鈉麻醉大鼠，暴露大鼠心臟，取其左心室血5 ml，并用500 ml 0.9%鹽水進(jìn)行快速灌注。隨后斷頭取腦，左側(cè)腦固定液進(jìn)行固定腦組織(低溫保存用固定10%甲醛溶液)，隨后按常規(guī)制作切片并染色。右側(cè)大腦勻漿(在低溫條件)。②腦組織切片使用免疫組織化學(xué)法雙重染色，切片置于室溫下進(jìn)行1.5 h干燥,然后用足量PPS液進(jìn)行反復(fù)洗滌，每次洗滌20 min。洗滌后將含0.1%TritonX-100山羊的血清滴注在大鼠腦海馬的組織切片上，孵育35～45 min。再次使用抗p-tau的單克隆抗體(1∶400)在4℃的孵化池孵化過夜。次日，在Cy3 標(biāo)記的二抗(1∶200)濕盒進(jìn)行孵化2.0～3.5 h。用免疫組化法對(duì)大腦組織切片進(jìn)行染色使用顯微鏡觀察并記錄結(jié)果。

1.6Western印跡法檢測(cè)腦組織p-tau蛋白在低溫條件下腦組織勻漿并提取p-tau蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。加入45 μg 蛋白樣品于凝膠泳道里，電泳使相關(guān)目的蛋白帶到達(dá)膠板的中間點(diǎn)即可斷電。電泳后進(jìn)行聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后，在室溫下用5%牛奶封閉PVDF 膜2 h，之后加注一抗(p-tau蛋白單克隆兔抗抗體，1∶400；p-tau蛋白抗大鼠的多克隆抗體，1∶10 000)4℃孵化過夜。TBST反復(fù)3次洗膜，每次洗膜5 min。注入兔二抗(辣根的過氧化物酶的標(biāo)記，1∶20 000)室溫孵化2 h，用TBST洗膜，5 min/次，連續(xù)3次。用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒發(fā)光，凝膠成像分析系統(tǒng)下進(jìn)行觀察，并利用相關(guān)灰度檢測(cè)軟件掃描出灰度值。

1.7數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)　果

2.1各組造模前后Y型水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表1。假手術(shù)組造模前后到達(dá)平臺(tái)時(shí)間和錯(cuò)誤率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；模型組造模后到達(dá)平臺(tái)時(shí)間顯著長(zhǎng)于造模前(P<0.05)，錯(cuò)誤率顯著高于造模前(P<0.01)；山茶籽組及E2組造模前后到達(dá)平臺(tái)時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，造模后錯(cuò)誤率均顯著降低(均P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組造模后錯(cuò)誤率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，山茶籽組及E2組造模后錯(cuò)誤率顯著降低(均P<0.01)；E2組與山茶籽組造模后錯(cuò)誤率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　各組大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間及錯(cuò)誤率比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.01

2.2各組p-tau蛋白陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較與假手術(shù)組(9.32±0.52)比較，模型組海馬CA1區(qū)p-tau蛋白陽性細(xì)胞數(shù)(75.12±8.73)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，山茶籽組(24.31±4.02)及E2組海馬CA1區(qū)p-tau蛋白陽性細(xì)胞數(shù)(18.17±2.12)明顯減少(均P<0.01)。

2.3各組腦組織p-tau蛋白水平比較見圖1。與假手術(shù)組(0.12±0.03)比較，模型組海馬CA1區(qū)p-tau蛋白光密度值(0.27±0.02)明顯增大(P<0.01)；與模型組比較，山茶籽組(0.16±0.043)及E2組p-tau蛋白的光密度值(0.15±0.02)明顯降低(均P<0.01)；E2組與山茶籽組p-tau蛋白的光密度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1　各組腦組織p-tau蛋白Western印跡電泳圖

3　討　論

神經(jīng)元骨架的主要成分是微管系統(tǒng)，其與神經(jīng)細(xì)胞多種功能活動(dòng)密切相關(guān)。微管由微管管狀蛋白和相關(guān)蛋白質(zhì)構(gòu)成，tau蛋白在微管相關(guān)蛋白中含量最高。正常腦組織中tau蛋白能夠促進(jìn)微管蛋白與微管相關(guān)蛋白結(jié)合從而聚集成微管； tau蛋白與微管相結(jié)合，降低微管的穩(wěn)定性，導(dǎo)致微管蛋白分解，并誘導(dǎo)微管進(jìn)一步形成微管束。tau蛋白的等位基因位置在17染色體的長(zhǎng)臂上。在正常人群中tau蛋白表達(dá)mRNA形式的差異，可剪輯出6種不同的同功異構(gòu)體。tau蛋白屬于磷酸基類蛋白，正常的成熟腦組織中tau蛋白分子中含有2～3個(gè)磷酸基團(tuán)。而在AD患者腦組織中的tau蛋白則表現(xiàn)出過度磷酸化，每分子tau蛋白的磷酸基含量有5～9個(gè)，形成多個(gè)磷酸基的p-tau蛋白,引起神經(jīng)纖維纏結(jié)及中樞神經(jīng)病理改變〔4〕，并喪失正常生物功能。

本研究結(jié)果證明山茶籽榨油后的茶麩醇提物在對(duì)AD大鼠模型治療效果明顯，因?yàn)檎ビ秃蟮纳讲枳褮堄辔?茶麩)提取物有E2樣作用，通過降低膽堿酯酶的生物活性，避免乙酰膽堿過度水解，增加腦組織膽堿濃度，增強(qiáng)大腦中樞的神經(jīng)興奮性和活動(dòng)能力〔5〕，從而改善AD大鼠模型臨床癥狀；山茶籽榨油后的茶麩乙醇提取物所含的植物性雌激素內(nèi)含豐富羥基成分，羥基有天然強(qiáng)抗氧化特性〔6〕，從而抑制p-tau蛋白和D-半乳糖在大腦組織堆積和損害，起到防治AD的作用；在腦組織里，雌激素與雌激素受體相結(jié)合還有擴(kuò)張腦組織血管效應(yīng)，腦組織的血流量增加，也可以使p-tau蛋白在腦組織的沉積減少、損害減輕〔7，8〕；植物性雌激素進(jìn)入體內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞合成和分泌α-分泌酶，α-分泌酶是水解淀粉蛋白前體酶，有促使淀粉蛋白前體分解和排出作用，減少p-tau蛋白在腦組織的沉積，從而消除或減少AD腦組織病理改變和臨床表現(xiàn)〔9〕。綜上，榨油后山茶籽的茶麩其乙醇提取物含有植物性雌激素〔10〕，有抗AD作用，特別在防治雌激素缺乏的AD作用更為明顯。

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4宋錦秋，陳曉春，張靜，等.人參皂苷Rb1通過JNK/p38 MAPK途徑減輕Aβ25-35 誘導(dǎo)的胎鼠皮層神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化〔J〕.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008；43(1)：29-34.

5趙莘瑜，許予明，常程.美金剛與多奈哌齊治療中度阿爾茨海默病的對(duì)照研究〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010;45(4)：597-9.

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10李海，陳建海，王金花，等.山茶籽聯(lián)合雌二醇對(duì)去卵巢大鼠骨組織的影響〔J〕.解剖學(xué)雜志，2012;35(3)：286-8,318.