glypican1在識(shí)別和鑒定早期胰腺癌中的作用

馬洪波　韓　風(fēng)

(河南省腫瘤醫(yī)院　鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科，河南　鄭州　450008)

90%的胰腺癌為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌，它是最難診治和預(yù)后最差的消化道惡性腫瘤之一，5年生存率小于1%〔1〕。早期胰腺癌臨床癥狀不明顯，患者一旦發(fā)現(xiàn)身體不適，癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散至全身多種組織和器官，近年來，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率明顯上升，早期診斷的準(zhǔn)確率很低，手術(shù)死亡率很高，治愈率很低，胰腺癌越早治療，效果越好，因此，早期診斷對胰腺癌患者的治療和預(yù)后具有重要意義〔2，3〕。Glypican1在胰腺癌患者體內(nèi)濃度很高，胰腺癌細(xì)胞釋放一種微小的環(huán)狀脂肪外泌體，其內(nèi)含有DNA、RNA和蛋白質(zhì)，膜表面和胞質(zhì)內(nèi)含有大量的glypican1。glypican1在胰腺癌和乳腺癌中選擇性地高表達(dá)，具有極高的特異性〔4〕。因此，在臨床檢測中，將glypican1作為檢測早期胰腺癌的標(biāo)志物具有重要的臨床意義〔5〕。本文分析glypican1在早期胰腺癌中的鑒別診斷價(jià)值。

1　對象與方法

1.1研究對象2013年1月至2015年1月河南省腫瘤醫(yī)院肝膽外科因胰腺癌行外科手術(shù)的患者50例，其中男30例，女20例，平均年齡(56.5±3.5)歲。因胰腺癌良性病變?nèi)缏砸认傺住⒁认倌蚁倭龊鸵认偌傩阅夷[等行外科手術(shù)的患者50例，其中男18例，女32例，平均年齡(60.5±2.5)歲。患者均符合《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，患者及其家屬均簽署書面知情同意書。

1.2檢測方法按常規(guī)方法收集胰腺良性病變患者和胰腺癌患者的肘靜脈血，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。超速離心收集glypican1+外泌體，用流式細(xì)胞儀分離glypican1+外泌體。兩組均于術(shù)前空腹采集外周血5 ml，離心分離血清，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測糖鏈抗原(CA)19-9水平，陰陽性臨界值為39 U/ml。計(jì)算CA19-9陽性率。提取病變組織和glypican+外泌體中的DNA，采用突變等位基因特異性擴(kuò)增法(PCR-MASA)檢測K-ras基因點(diǎn)突變。以病變組織診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算glypican1+外泌體檢測的敏感性特異性和診斷準(zhǔn)確率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1glypican1+外泌體檢測胰腺癌的效能glypican1+外泌體檢測胰腺癌的敏感度、特異性和準(zhǔn)確性均顯著高于CA19-9和K-ras基因突變檢測(P<0.05)。見表1。

表1　glypican1+外泌體檢測胰腺癌的效能〔n=50,n(%)〕

與glypican1+外泌體比較：1)P<0.05

2.2良性組和胰腺癌組glypican1+外泌體陽性率比較良性組和胰腺癌組glypican1+外泌體陽性率明顯高于CA19-9和K-ras基因突變檢測(P<0.05)；與良性組相比，胰腺癌組的glypican1+外泌體陽性率更高(P<0.05)。見表2。

與glypican1+外泌體比較：1)P<0.05；與良性組比較：2)P<0.05

3　討　論

胰腺癌主要指胰腺外分泌胰腺癌，臨床上最常見的是導(dǎo)管腺癌，預(yù)后極差，絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)不能采用手術(shù)治療。

硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)通過磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜上，glypican是HSPG中很特殊的一種類型，目前，哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)6種glypican，glypican通常作為共受體易化配體和受體的相互作用〔6，7〕。glypican在正常發(fā)育和多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，在不同癌癥中的表達(dá)差異很大，glypican1，3，5都與腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，主要影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡，表達(dá)該蛋白的基因突變后，癌細(xì)胞的增殖和凋亡均發(fā)生很大改變，這是癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因。glypican1在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)量增加，glypican5與橫紋肌腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，glypican3在腫瘤中的作用待定，有一些研究表明，它可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，但其在間皮瘤、卵巢癌和乳腺癌中處于沉默狀態(tài)〔8～11〕。

胰腺癌是致死率極高的一種癌癥。每100例胰腺癌患者中，只有3例可以存活5年以上，而且，近40年來，此癌癥的存活率并沒有提高。由于胰腺癌是最難早期發(fā)現(xiàn)和治療的癌癥之一，確診時(shí)常常已到晚期，只有15%左右的患者適合于接受手術(shù)，在早期診斷胰腺癌可以降低胰腺癌的死亡率，因此，胰腺癌的早期診斷一直是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，尋找準(zhǔn)確率高的生物學(xué)標(biāo)志物迫在眉睫〔12～14〕。Glypican在各種癌癥中的表達(dá)有很大差異，在子宮內(nèi)膜癌、肺癌、卵巢癌和食管癌中表達(dá)量很低，在胰腺癌、乳腺癌、肝癌、大腸癌和黑色素瘤中表達(dá)量很高。在不同的癌癥中，glypican發(fā)揮不同的作用，甚至可能起到完全相反的作用〔10，15，16〕。

胰腺癌外泌體含有g(shù)lypican1蛋白，可以作為一種潛在的非侵入性的診斷和篩查工具，在臨床上用于檢測和診斷有可能尚處于適合手術(shù)治療階段的早期胰腺癌。胰腺癌的早期診斷十分困難，其臨床癥狀與急慢性胰腺炎很相似，有時(shí)候很難區(qū)分胰腺癌和胰腺炎，因此，胰腺癌的早期診斷成為提高胰腺癌患者生存率和預(yù)后的關(guān)鍵。

外泌體是由癌細(xì)胞分泌至細(xì)胞外的一種直徑在50～150 nm的顆粒，由磷脂雙分子層包裹著DNA、RNA和蛋白質(zhì)，可以隨著血液系統(tǒng)循環(huán)，癌癥外泌體不僅僅是一種生物標(biāo)記物，分析外泌體可以獲得許多癌癥特異性的遺傳突變信息〔17，18〕。早期胰腺癌患者血液中含有富含glypican1的循環(huán)外泌體，具有絕對的特異性和敏感性，這些早期胰腺癌患者手術(shù)切除癌組織后，glypican1循環(huán)外泌體顯著下降。檢測循環(huán)外泌體具有很多優(yōu)勢，只需少量新鮮或凍存的胰腺癌患者血液，可同時(shí)分析DNA、RNA和蛋白質(zhì)等，與循環(huán)腫瘤細(xì)胞和常用的CA19-9相比，具有更高的特異性和準(zhǔn)確性，價(jià)格低廉，假陽性低。據(jù)報(bào)道，在胰腺癌小鼠模型中，磁共振成像(MRI)還未檢測到胰腺癌疾病跡象時(shí)，glypican1外泌體就可以準(zhǔn)確檢測到早期胰腺癌〔19，20〕。在早期胰腺癌臨床檢測中，glypican1循環(huán)外泌體的檢測可與影像學(xué)聯(lián)合使用，提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確率。癌癥細(xì)胞和正常細(xì)胞都能分泌外泌體，但是目前并無特異性的標(biāo)志物來區(qū)分這兩種外泌體，因此，發(fā)現(xiàn)并分離癌癥特異性的外泌體且不被正常細(xì)胞的外泌體污染，對癌癥的診斷和治療具有重要的臨床意義〔20～22〕。CA19-9是最常用的胰腺癌標(biāo)志物之一，但由于其特異性很低，在臨床上的應(yīng)用受到很多限制。

癌癥細(xì)胞可以釋放數(shù)百萬攜帶自身蛋白和遺傳物質(zhì)的外泌體，通過循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)受納器官，促發(fā)炎癥和血管形成等過程，讓轉(zhuǎn)移至受納器官的腫瘤細(xì)胞更容易增殖并形成新的轉(zhuǎn)移灶，進(jìn)一步驗(yàn)證了Paget在126年前提出的“種子與土壤理論”學(xué)說〔23～25〕。

從早期胰腺癌患者血液中分離出的glypican1循環(huán)外泌體中含有K-ras、p53、Tp53、p16、Ink4a/Arf和DPC4/Smad4等基因突變的DNA片段。K-ras家族有3個(gè)成員，即H-ras、N-ras和K-ras，K-ras癌基因點(diǎn)突變激活是胰腺癌最早發(fā)生的點(diǎn)突變，在胰腺癌組織中最為常見，臨床上常用來診斷早期胰腺癌，在患者的胰腺組織、胰液、糞便、膽汁及血漿中均可檢測到K-ras突變，但其靈敏度和特異性均不穩(wěn)定。K-ras常見基因突變位點(diǎn)為第12、12、61位密碼子，以第12為密碼子的突變最為常見。

本研究結(jié)果表明，與CA19-9和K-ras基因突變檢測相比，glypican1+外泌體檢測具有早期識(shí)別胰腺癌更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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