吳茱萸和臭辣吳萸果實化學(xué)成分及不同采收時間主要成分含量的變化

李懿恒， 黃佳楠， 劉　瀟， 印　敏， 劉　飛， 馮　煦， 王奇志

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺， 江蘇 南京 210014〕

吳茱萸〔Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.〕及其變種石虎〔E.rutaecarpavar.officinalis(Dode) Huang〕和疏毛吳茱萸〔E.rutaecarpavar.bodinieri(Dode) Huang〕的干燥近成熟果實均為中藥材吳茱萸的原植物，可散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉，其天然成分對心血管系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)也有一定功效[1]171，[2-3]。吳茱萸果實主要含生物堿、苦味素和揮發(fā)油等[4]，吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素含量是吳茱萸藥材質(zhì)量的評價標(biāo)準(zhǔn)[1]172。近年來，對吳茱萸的研究多集中于其不同產(chǎn)地和品種的藥用成分研究[5-6]。同屬的臭辣吳萸(E.fargesiiDode)果實在湖北民間用作吳茱萸代品，具相同藥效[7]。為進(jìn)一步明確吳茱萸和臭辣吳萸果實的化學(xué)成分，弄清藥用有效成分隨采收時間的變化規(guī)律，作者對吳茱萸和臭辣吳萸果實的化學(xué)成分進(jìn)行了分離和鑒定，并分析了不同采收時間二者果實中主要成分含量的變化。

1　材料和方法

1.1　材料

吳茱萸和臭辣吳萸的果實均采自南京中山植物園藥用植物園內(nèi)，經(jīng)姚淦副研究員鑒定。吳茱萸和臭辣吳萸果實的采集時間分別為2017年的7月初至9月底及6月中旬至9月初；均按果熟過程采集，每隔7～15 d采收1次。每次采集果實3份，每份25 g以上，于50 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，密封保存、備用；其中，8月14日采集的果實樣品用于成分鑒定。

主要儀器為1260UPLC-6530Q-TOF-MS液質(zhì)聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源(ESI)(美國Agilent Technologies公司)。去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹諾酮、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿對照品均為本實驗室自制(純度高于98.0%)。

1.2　方法

1.2.1UPLC-Q-TOF-MS分析色譜條件：Agilent ZORBAX SB-AQ C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，1.8 μm)。流動相A為甲醇、流動相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸，梯度洗脫流程為20%～80%A(1～50 min)、80%～100%A(50～80 min)、100%A(80～100 min)；流速0.3 mL·min-1，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL；200～400 nm全波長掃描，吲哚喹唑啉類、喹諾酮類和檸檬苦素的檢測波長分別為290、325和215 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；質(zhì)量掃描范圍(m/z)100～1 000；毛細(xì)管電壓4 000 V；碎裂電壓180 V；干燥氣(N2)流速10 L·min-1，溫度350 ℃；霧化氣壓力344.75 kPa；碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量35 eV；碰撞氣為N2。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取上述對照品適量，用甲醇分別溶解并配制成質(zhì)量濃度分別為1.00、1.00、0.40、0.65、1.04、1.01和1.06 mg·mL-1的對照品溶液。

分別精密吸取上述對照品溶液0.01、0.05、0.10、0.25和0.50 mL，用甲醇補足至1.00 mL，按上述色譜和質(zhì)譜條件測定；并以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x)繪制各對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。去氫吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=(4.22×103)x+203.63(r=0.999 4)，線性范圍0.05～5.00 μg；檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=(1.59×103)x+35.34(r=0.999 7)，線性范圍0.05～5.00 μg；吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=(6.30×103)x-138.11(r=0.999 1)，線性范圍0.02～2.00 μg；吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=(1.21×103)x+101.77(r=0.999 6)，線性范圍0.03～3.25 μg；1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=(6.16×103)x+119.13(r=0.999 5)，線性范圍0.05～5.02 μg；吳茱萸卡品堿標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=(5.90×103)x+92.23(r=0.999 0)，線性范圍0.05～5.01 μg；二氫吳茱萸卡品堿標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=(6.45×103)x+8.06(r=0.999 8)，線性范圍0.05～5.03 μg。

1.2.3樣品溶液制備和測定稱取樣品0.50 g，加入甲醇20 mL，常溫下浸泡1 h，稱量質(zhì)量；超聲(100 kHz，40 ℃)提取60 min，用甲醇補足損失的質(zhì)量；取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得樣品溶液。按上述色譜和質(zhì)譜條件測定，每個樣品3份，每份樣品重復(fù)測定3次。

1.2.4方法學(xué)考察取吳茱萸堿對照品溶液，按上述色譜和質(zhì)譜條件測定6次，峰面積的RSD值為0.98%～3.04%，表明儀器精密度良好。取2017年8月4日采集的吳茱萸果實樣品溶液，分別在0、4、8、12、18和24 h按上述色譜和質(zhì)譜條件測定，峰面積的RSD值為0.89%～3.65%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。取2017年8月4日采集的吳茱萸果實樣品6份并制成樣品溶液，按上述色譜和質(zhì)譜條件測定，峰面積的RSD值為1.28%～2.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.3　數(shù)據(jù)分析

使用MassHunter 5.0工作站和PCDL B.03.01數(shù)據(jù)庫對各樣品的總離子流圖和質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對各化合物相對分子質(zhì)量的實際值與理論值進(jìn)行比較，結(jié)合二級質(zhì)譜信息和相關(guān)文獻(xiàn)資料[8-10]鑒定化合物。依據(jù)各對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法確定樣品溶液中各化合物的質(zhì)量，并根據(jù)公式“化合物含量=〔(化合物質(zhì)量×提取量)/(果實質(zhì)量×進(jìn)樣量)〕×100%”計算供試果實樣品中各化合物的含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

2結(jié)果和分析

2.1　吳茱萸和臭辣吳萸果實的共有成分分析

從吳茱萸和臭辣吳萸果實中鑒定出13種共有成分(表1)，包括去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹諾酮、1-甲基-2-[(Z)-5-十一烯]-4(1H)-喹諾酮、1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹諾酮、吳茱萸卡品堿、1-甲基-2-十二烷基-4(1H)-喹諾酮、1-甲基-2-[(6Z，9Z)-6，9-十五碳二烯]-4(1H)-喹諾酮、二氫吳茱萸卡品堿、1-甲基-2-[(Z)-9-十五烯]-4(1H)-喹諾酮和1-甲基-2-十五烷基-4(1H)-喹諾酮，這13種共有成分主要為吲哚喹唑啉類、檸檬苦素和喹諾酮類等。

表1吳茱萸和臭辣吳萸果實的共有成分

Table1CommonconstituentsinfruitsofEvodiarutaecarpa(Juss.)Benth.andE.fargesiiDode

保留時間/minRetentiontime正離子Positiveion(m/z)相對分子質(zhì)量Relativemolecularmass特征碎片離子Characteristicfragmention(m/z)化合物Compound22.61302.1471301258,272,286dehydroevodiamine37.01471.2003470161,425,443limonin49.68304.1414303134,161,230evodiamine54.01288.1213287169,273rutaecarpine59.27286.2497285173,186,2301-methyl-2-nonyl-4(1H)-quinolone61.75312.2298311173,1861-methyl-2-[(Z)-5-undecenyl]-4(1H)-quinolone66.35314.29993131731-methyl-2-undecyl-4(1H)-quinolone68.52340.2835339186evocarpine69.84328.2609328173,1861-methyl-2-dodecyl-4(1H)-quinolone70.96366.31743651861-methyl-2-[(6Z,9Z)-6,9-pentadecadienyl]-4(1H)-quinolone73.11342.3197342173dihydroevocarpine74.78368.31023671861-methyl-2-[(Z)-9-pentadecenyl]-4(1H)-quinolone78.90370.3204369173,1861-methyl-2-pentadecyl-4(1H)-quinolone

2.2　不同采收時間果實中主要成分含量的動態(tài)變化

實驗結(jié)果(表2)表明：在吳茱萸果實中，吲哚喹唑啉類(吳茱萸堿、吳茱萸次堿和去氫吳茱萸堿)含量在9月5日達(dá)到峰值(1.509 7%)，檸檬苦素含量在8月24日達(dá)到峰值(0.429 2%)，喹諾酮類〔1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹諾酮、吳茱萸卡品堿和二氫吳茱萸卡品堿〕含量在8月14日達(dá)到峰值(0.189 6%)。在臭辣吳萸果實中，吲哚喹唑啉類含量在8月14日達(dá)到峰值(0.215 2%)，檸檬苦素含量在8月4日達(dá)到峰值(0.521 1%)，喹諾酮類含量在7月17日達(dá)到峰值(0.215 9%)。

果初期吳茱萸果實中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和二氫吳茱萸卡品堿的含量均低于臭辣吳萸，但隨果實成熟，3種成分的含量明顯上升，峰值均高于臭辣吳萸。果初期吳茱萸果實中檸檬苦素含量雖高于臭辣吳萸，但隨果實成熟，后者果實中檸檬苦素含量增幅明顯，導(dǎo)致中后期采收的吳茱萸果實中檸檬苦素含量低于后者。在整個果期，吳茱萸果實中去氫吳茱萸堿和吳茱萸卡品堿的含量均高于臭辣吳萸，而1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹諾酮的含量則低于臭辣吳萸。

表2不同采收時間吳茱萸和臭辣吳萸果實中主要成分的含量

Table2ContentsofmainconstituentsinfruitsofEvodiarutaecarpa(Juss.)Benth.andE.fargesiiDodeatdifferentharvestingtimes

采收時間Harvestingtime(MM-DD)吳茱萸果實中主要成分的含量/%1)ContentofmainconstituentsinE.rutaecarpafruit1)1234567采收時間Harvestingtime(MM-DD)臭辣吳萸果實中主要成分的含量/%1)ContentofmainconstituentsinE.fargesiifruit1)123456707-100.04200.07020.00980.03220.00400.03020.012706-150.00720.05410.01320.03290.11260.00540.020707-170.08470.12150.01930.03970.01050.04720.018006-300.00810.06810.01660.03630.12560.00750.022107-240.12330.23570.02880.07290.01620.06600.028107-100.02230.10820.02570.04440.12970.00990.028708-040.14690.32280.06160.12390.02070.07800.041407-170.03460.32430.04790.08720.16660.01380.035508-140.21050.34680.23340.29090.02400.08870.076907-240.04120.47540.04510.08410.12620.01100.041408-240.24300.42920.33900.36880.01350.06450.043008-040.05650.52110.05350.09140.10550.00890.031109-050.18090.34680.60420.72460.01170.05230.061808-140.07310.50470.06630.07580.06620.01180.022409-150.15500.30390.55430.73130.01040.04430.049108-240.06180.46640.04820.07440.05910.01010.016409-250.15720.27810.58310.70170.01020.05200.052609-050.04730.39830.03210.06530.05000.00760.0122

1)1： 去氫吳茱萸堿Dehydroevodiamine； 2： 檸檬苦素Limonin； 3： 吳茱萸堿Evodiamine； 4： 吳茱萸次堿Rutaecarpine； 5： 1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹諾酮1-methyl-2-undecyl-4(1H)-quinolone； 6： 吳茱萸卡品堿Evocarpine； 7： 二氫吳茱萸卡品堿Dihydroevocarpine.

3討論和結(jié)論

從吳茱萸和臭辣吳萸果實共鑒定出13種共有成分，主要為吲哚喹唑啉類、檸檬苦素和喹諾酮類3類成分。根據(jù)果期吳茱萸和臭辣吳萸果實中7種主要成分含量的動態(tài)變化趨勢，確定吳茱萸果實的適宜采收期為8月底至9月初，臭辣吳萸果實的適宜采收期為7月底至8月中。吳茱萸和臭辣吳萸果實中3類成分的動態(tài)變化趨勢基本一致，均隨果熟過程先升高后降低，但檸檬苦素和喹諾酮類含量達(dá)到峰值的時間均早于吲哚喹唑啉類；臭辣吳萸果實中檸檬苦素和喹諾酮類含量的峰值均略高于吳茱萸，而其吲哚喹唑啉類含量的峰值遠(yuǎn)低于吳茱萸。從整體上看，在適宜的采收期內(nèi)臭辣吳萸果實中3類成分的總含量低于吳茱萸，其藥材品質(zhì)略低于后者，因此，將臭辣吳萸作為吳茱萸替代品入藥有一定的合理性，但需進(jìn)一步研究其藥材品質(zhì)、用量及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

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